三七三醇皂苷對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

李春桃，韓言秀，杜曉薇，左中夫△

三七三醇皂苷對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

李春桃1，韓言秀2，杜曉薇2，左中夫1△

目的 探討三七三醇皂苷（PTS）對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用，并從星形膠質(zhì)細(xì)胞角度揭示其機(jī)制。方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、糖尿病組及PTS治療組，每組8只。于SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型，對照組為正常SD大鼠，PTS治療組為糖尿病大鼠給予PTS治療。檢測大鼠血糖和體質(zhì)量，3個月后，水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，免疫組化染色檢測腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，Western blot法檢測神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）表達(dá)。結(jié)果 糖尿病組較對照組學(xué)習(xí)記憶能力減退，腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體萎縮、突起變細(xì)，腦海馬區(qū)GFAP及GDNF表達(dá)明顯減少（均P＜0.05）。PTS組較糖尿病組學(xué)習(xí)記憶能力改善，腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改善、GFAP及GDNF表達(dá)明顯恢復(fù)（均P＜0.05）。結(jié)論 PTS能恢復(fù)糖尿病大鼠腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，恢復(fù)GDNF表達(dá)，提高糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

糖尿??；神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)；模型，動物；學(xué)習(xí)記憶；三七三醇皂苷；星形膠質(zhì)細(xì)胞；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

糖尿病可使患者學(xué)習(xí)記憶能力下降，表現(xiàn)為學(xué)齡期兒童學(xué)習(xí)成績下降，成年人工作能力減退，老年人易患老年癡呆等。1966年“糖尿病腦病”（diabet?ic encephalopathy）概念首次提出，但其機(jī)制仍未清楚。三七三醇皂苷（PTS）是從三七中提取出的有效藥用成分，能改善缺血再灌注的腦功能［1］，營養(yǎng)神經(jīng)元［2］，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性［3］，而膠質(zhì)細(xì)胞活性降低是糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因［4］。但PTS對糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力的影響機(jī)制尚不清楚，是否通過星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮作用更不明確。本研究旨在探討PTS對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，并從星形膠質(zhì)細(xì)胞角度揭示其中的細(xì)胞及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 24只8周齡清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～ 230 g，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體購自Ab?cam公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司；PTS購自成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠（每粒含PTS 100 mg）。

1.2 動物分組及給藥 用隨機(jī)數(shù)字法將24只大鼠分為對照組、糖尿病組及PTS治療組，每組8只。對照組正常喂養(yǎng)，糖尿病組與PTS治療組大鼠腹腔注射 1%STZ溶液（60 mg/kg），48 h后測尾靜脈血糖，均＞15.0 mmol/L，為糖尿病大鼠模型。對照組及糖尿病組僅給予生理鹽水；PTS治療組大鼠以PTS溶于生理鹽水后按100 mg/次，2次/d灌胃給藥，均持續(xù)3個月。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 所有大鼠于給藥第4天進(jìn)行水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，每天4次，連續(xù)5 d，水池中平臺低于水面1 cm，記錄第5天大鼠從入水到登上平臺所用時間（逃避潛伏期），檢測大鼠學(xué)習(xí)能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)第6天（即給藥第9天）進(jìn)行水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去水下平臺，記錄大鼠游泳速度及穿越原平臺所在位置的次數(shù)，檢測大鼠記憶能力。

1.4 Western blot檢測腦海馬區(qū)GFAP及GDNF表達(dá) 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死取腦，剝離海馬，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，分別以β-actin、GFAP及GDNF一抗孵膜，4℃過夜，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育3 h，ECL試劑盒發(fā)光顯影，以β-actin為內(nèi)參檢測目的蛋白表達(dá)量。

1.5 免疫組織化學(xué)染色觀察腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài) 大鼠海馬以4%多聚甲醛固定，制備冰凍切片，經(jīng)10%正常山羊血清封閉后以小鼠抗GFAP（1∶4 000）4℃孵育過夜，再以A488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶500）室溫孵育4 h，封片，顯微鏡下觀察GFAP染色結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較用F檢驗(yàn)，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖及體質(zhì)量 分組處理前各組血糖及體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3個月后，糖尿病組及PTS治療組血糖較對照組增高，體質(zhì)量降低（均P＜0.01），糖尿病組與PTS治療組之間血糖及體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Blood glucose and body weight in each group表1 各組大鼠血糖及體質(zhì)量 （n=8，±s）

Tab.1 Blood glucose and body weight in each group表1 各組大鼠血糖及體質(zhì)量 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.01

組別對照組糖尿病組PTS治療組F血糖（mmol/L）分組處理前4.5±0.4 4.4±0.3 4.2±0.6 7.57 3個月后4.8±0.5 19.2±1.4a20.1±1.8a223.46＊＊體質(zhì)量（g）分組處理前213.6±4.9 218.6±4.7 221.0±5.3 9.32 3個月后495.3±10.7 321.4±8.6a330.6±7.1a147.67＊＊

2.2 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn) 糖尿病組較對照組逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)減少，第1象限游泳時間百分比下降（均P＜0.01）；PTS治療組逃避潛伏期、穿越原平臺所在位置次數(shù)以及第1象限游泳時間百分比較對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組大鼠游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、3。

Tab.2 Performance in water maze and expression of GFAP and GDNF in hippocampus表2 大鼠水迷宮成績及腦海馬區(qū)GFAP、GDNF表達(dá)（n=8，±s）

Tab.2 Performance in water maze and expression of GFAP and GDNF in hippocampus表2 大鼠水迷宮成績及腦海馬區(qū)GFAP、GDNF表達(dá)（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與糖尿病組比較，P＜0.01；表3同

組別對照組糖尿病組PTS治療組F逃避潛伏期（s）8.4±3.6 12.4±4.8a9.1±5.2b123.70＊＊穿越平臺次數(shù)4.2±1.2 2.1±0.8a3.8±1.6b165.49＊＊游泳速度（cm/s）26.7±1.7 27.4±5.8 25.1±2.5 14.72 GFAP （%）73.1±4.3 52.6±4.6a71.8±5.7b205.83＊＊GDNF （%）52.1±3.8 32.7±2.5a49.6±3.1b216.79＊＊

Tab.3 Percentage of time spend in each quadrant表3 大鼠水迷宮各象限游泳時間百分比（n=8，%，±s）

Tab.3 Percentage of time spend in each quadrant表3 大鼠水迷宮各象限游泳時間百分比（n=8，%，±s）

組別對照組糖尿病組PTS治療組F 第1象限39.8±1.7 30.7±1.6a36.5±1.6b98.46＊＊第2象限21.2±1.4 22.9±1.9 20.7±1.2 13.42 第3象限19.6±1.6 22.5±2.6 20.3±2.4 12.53 第4象限19.4±1.2 23.9±1.3 22.5±2.5 13.84

2.3 各組大鼠腦海馬區(qū)GFAP及GDNF表達(dá) 糖尿病組較對照組GDNF、GFAP表達(dá)減少（均P＜0.01），而PTS治療組海馬區(qū)的GFAP及GDNF表達(dá)量較對照組無明顯變化（均P＞0.05），見表2、圖1。

2.4 PTS對糖尿病大鼠腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響 糖尿病組較對照組腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞萎縮變小，突起變短、變細(xì)；而PTS治療組較糖尿病組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)，見圖2。

Fig.1 Expression of hippocampal GFAP and GDNF圖1 各組大鼠腦海馬區(qū)GFAP及GDNF蛋白表達(dá)

3 討論

研究顯示，糖尿病患者早期學(xué)習(xí)記憶能力減退不明顯，但隨著病程的延長，糖尿病對學(xué)習(xí)記憶功能的損害日益顯著，患者工作能力均明顯下降，常產(chǎn)生挫敗感，進(jìn)而引發(fā)心理問題［5］。對于慢性腦缺血大鼠，PTS能抑制腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善缺血性腦卒中大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［1］。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠游泳速度無明顯差異，表明3個月糖尿病大鼠運(yùn)動功能未受明顯影響。糖尿病組較對照組出現(xiàn)了逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)減少、第1象限（原平臺所在象限）游泳時間百分比降低的情況，提示糖尿病大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能障礙。PTS治療組的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、第1象限游泳時間百分比且與對照組無明顯差別，提示PTS治療組較糖尿病組學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)，PTS能改善糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)受多因素影響，星形膠質(zhì)細(xì)胞活性下降是糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因［4］。研究表明，PTS能促進(jìn)腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)細(xì)胞增殖，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞活性［3］。

有研究認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞活性改變主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)變化及GFAP表達(dá)變化［6］。本研究顯示，糖尿病組較對照組學(xué)習(xí)記憶能力下降的同時，腦海馬區(qū)GFAP表達(dá)也明顯降低，且星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)了胞體萎縮變小，突起變短、變細(xì)等活性降低的形態(tài)學(xué)改變；而PTS治療組較糖尿病組學(xué)習(xí)記憶功能改善的同時，大鼠腦海馬區(qū)GFAP表達(dá)及星形膠質(zhì)形態(tài)較對照組無明顯差異，提示PTS可能通過恢復(fù)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性改善了糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。有研究認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌多種細(xì)胞因子作用于突觸間隙，調(diào)節(jié)突觸可塑性，影響突觸長時程增強(qiáng)、長時程抑制，從而調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力［7］。GDNF是星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元存活，抑制神經(jīng)元凋亡，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的功能［8-9］。本研究中糖尿病組較對照組海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性下降的同時，GDNF表達(dá)明顯減少，而且學(xué)習(xí)記憶功能明顯減退；PTS治療組較糖尿病組海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及GDNF表達(dá)得到了恢復(fù)，學(xué)習(xí)記憶功能也得到改善。因此，筆者認(rèn)為影響GDNF表達(dá)變化可能是PTS恢復(fù)糖尿病大鼠腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，提高認(rèn)知功能的重要分子機(jī)制之一。

（圖2見插頁）

［1］Zhao JM，Xiao JJ，Shan SD，et al.Effects of notogisenoside on cogni?tive impairment，oxidative stress and cognition related genes in rats with chronic cerebral ischemia［J］.Chin J Cerebrovac Dis（Electron?ic Edition），2009，3（6）:283-287.［趙江民，肖俊杰，單圣道，等.三七三醇皂苷減輕氧化應(yīng)激、影響認(rèn)知相關(guān)基因改善慢性缺血性腦血管病大鼠認(rèn)知功能［J］.中華腦血管病雜志（電子版），2009，3 （6）:283-287］.

［2］Zhu DM，Liu XZ.Protective effects of panax notoginseng of retinal ganglion cells in diabetic rat［J］.Tianjin Med J，2013，41（11）:1103-1105.［朱德淼，劉學(xué)政.三七三醇皂苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.天津醫(yī)藥，2013，41（11）:1103-1105］.

［3］Chen JP，Ma QS.Effect of PTS on cell proliferation and astrocyte of subventricular zone in rats with cerebral ischemia［J］.China Phar?macy，2010，21（43）:4061-4063.［陳俊萍，馬祁生.三七三醇皂苷對腦缺血大鼠腦室下區(qū)細(xì)胞增殖及星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.中國藥房，2010，21（43）:4061-4063］.

［4］Zuo ZF，Wang W，Niu L，et al.RU486（mifepristone）ameliorates cognitive dysfunction and reverses the down-regulation of astrocyt?ic N-myc downstream-regulated gene 2（NDRG2）in streptozoto?cin-induced type 1 diabetic rats［J］.Neuroscience，2011，190:156-165.

［5］Biessels GJ.Sweet memories:20 years of progress in research on cognitive functioning in diabetes［J］.Eur J Pharmacol，2013，719（1-3）:153-160.

［6］Rajkowska G，Stockmeier CA.Astrocyte pathology in major depres?sive disorder:insights from human postmortem brain tissue［J］.Curr Drug Targets，2013，14（11）:1225-1236.

［7］Ben Achour S，Pascual O.Astrocyte-neuron communication:func?tional consequences［J］.Neurochem Res，2012，37（11）:2464-2473.

［8］Nedergaard M，Verkhratsky A.Artifact versus reality--how astro?cytes contribute to synaptic events［J］.Glia，2012，60（7）:1013-1023.

［9］Sopova K，Gatsiou K，Stellos K，et al.Dysregulation of neurotrophic and haematopoietic growth factors in Alzheimer's disease:from pathophysiology to novel treatment strategies［J］.Curr Alzheimer Res，2014，11（1）:27-39.

（2014-03-27收稿 2014-09-30修回）

（本文編輯 陸榮展）

Roles of panaxtrial saponins in cognition and memory of diabetic rat and in activity of astrocytes

LI Chuntao1，HAN Yanxiu2，DU Xiaowei2，ZUO Zhongfu1△
1 Department of Human Anatomy，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2 College of Basic Medical Science，Liaoning Medical University
△Corresponding Author E-mail：zuozhongfu9807@163.com

Objective To explore protective effects of panaxtrial saponins（PTS）on cognition and memory of diabetic rats and to reveal its mechanism by which might involve regulating activity of astrocytes.Methods SD rats（n=24）were ran?domly assigned into control，diabetic and PTS-treated groups（n=8 in each group）.Rat diabetic model was induced through streptozotocin injection intraperitoneally.Rats in control group were native rats，and rats in PTS-treated group were diabetic rats that were administered with PTS.Body weight and blood glucose were monitored through the experiments.Three months later，state of cognition was examined by methods of water maze.Hippocampal astrocyte morphology were detected by immu?nohistochemistry，and the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）and glial fibrillary acidic protein （GFAP）in hippocampus were revealed by Western blot.Results Compared with control group，diabetic group showed cog?nitive dysfunction，atrophic astrocyte soma，shrinked astrocyte processes，and down-regulation of hippocampal GFAP and GDNF（P＜0.05）.Compared with diabetic group，PTS-treated group exhibited improved cognition and morphology of hippo?campal astrocyte，and reversed expression of GFAP and GDNF in diabetic hippocampus（P＜0.05）.Conclusion PTS re?versed astrocytic reactivity as well as expression of GDNF and GFAP in diabetic hippocampus and ameliorated diabetic cog?nitive dysfunction.

diabetes mellitus；glial fibrillary acidic protein；models，animal；learning and memory；panaxtrial saponins；astrocytes；GDNF

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.008

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81300931）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013022055）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310160004）；遼寧醫(yī)學(xué)院“校長基金”資助項(xiàng)目（XZJJ20130105-03）；2013年度遼寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

1遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室（郵編121001）；2遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

△E-mail：zuozhongfu9807@163.com