志賀菌1、2類整合子及ISCR1攜帶情況與耐藥性的關系

董利娟，楊賢，王俊，祁偉△，呂星，梁帆

專題研究·細菌與耐藥

志賀菌1、2類整合子及ISCR1攜帶情況與耐藥性的關系

董利娟1，楊賢1，王俊1，祁偉1△，呂星2，梁帆3

目的 了解天津地區志賀菌1類、2類整合子及插入序列共同區（ISCR1）攜帶情況及其與耐藥性的關系。方法 K-B紙片擴散法測定臨床分離的159株志賀菌的藥敏情況。以煮沸法制備細菌總DNA作為PCR擴增模板。采用PCR方法擴增1類、2類整合子及ISCR1并測序分析。PCR產物直接測序，結果經BLAST程序與Gen?Bank數據庫標準株比對分析。結果 159株志賀菌中，53株福氏志賀菌對四環素的耐藥率最高88.68%，其次是鏈霉素81.13%、氯霉素及SMZco均為56.60%，多重耐藥率77.36%；106株宋氏志賀菌對氨芐西林的耐藥率最高97.17%，其次是SMZco95.28%、四環素83.96%、慶大霉素76.42%，多重耐藥率98.11%。1類整合子陽性118株，其中典型1類整合子23株，共有5種基因盒，分別為aadA2、aadA1、dfrⅠ、blaoxa-10及blaoxa-1；非典型1類整合子95株，基因包括intI1、aadA、blaoxa-1和IS1等；2類整合子陽性89株，其基因盒有dfrA1、satl及aadA1；1類、2類整合子同時陽性的菌株70株。未發現ISCR1陽性菌株。整合子陽性菌株中多重耐藥率高于整合子陰性菌株（90.65%vs 50%，P＜0.05）。結論 1、2類整合子廣泛存在于志賀菌中且與志賀菌的多重耐藥相關。

志賀菌屬；整合子類；耐藥性，微生物；序列共同區

細菌性痢疾居我國法定傳染病發病率的第3位，是我國最常見的感染性腹瀉之一［1］。隨著抗生素的廣泛使用，志賀菌耐藥率上升，并呈現多重耐藥趨勢。通過對細菌耐藥機制的研究發現，整合子及插入序列共同區（ISCR）作為一種可移動元件，與細菌耐藥率上升及多重耐藥趨勢的出現密切相關［1］。本研究對分離出的志賀菌臨床株攜帶1類、2類整合子及ISCR1情況進行調查并分析其與耐藥性的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 收集分離自天津醫科大學第二醫院、天津市兒童醫院和天津醫科大學總醫院3所三級甲等醫院腸道門診就診患者的糞便標本中志賀菌共計159株。經常規生化及血清凝集試驗證實，其中包括福氏志賀菌53株，宋氏志賀菌106株。ISCR1陽性菌株2414及質控菌株ATCC25922為本研究所保存。

1.2 培養基及藥敏紙片 水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。藥敏紙片包括氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、慶大霉素、鏈霉素、四環素、阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復方新諾明（SMZco）、頭孢哌酮、氯霉素共14種，購自北京天壇生物制品研究所。引物合成及PCR產物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 抗菌藥物敏感試驗 所有菌株嚴格按照2012年臨床實驗室標準化研究所（CLSI）的規定，采用改良Kirby-Bauer紙片擴散法進行檢測，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 細菌總DNA的提取 采用煮沸法提取細菌總DNA［2］。

1.3.3 志賀菌相關基因的檢測與測序分析 引物設計及反應體系、條件參照文獻［3-5］的方法進行。7對引物分別擴增1類整合子整合酶、1類整合子可變區、3'保守末端（3'CS）、非典型1類整合子基因盒、2類整合子整合酶、2類整合子可變區及插入序列共同區ISCR1，見表1。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，凝膠成像系統下觀察結果。測序結果經BLAST程序與GenBank數據庫公布的標準菌序列進行比對、分析，確定基因型。

1.3.4 主要實驗儀器 DNA擴增熱循環（PCR）儀（德國Ep?pendorf公司）、DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）、GEL?DOC-200型凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）及Quanti?ty One 4.6版分析軟件。

1.4 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件，χ2檢驗進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏試驗 159株志賀菌藥敏結果顯示，福氏志賀菌對四環素的耐藥率最高，其次是鏈霉素、氯霉素及SMZco；多重耐藥率77.36%。宋氏志賀菌對氨芐西林的耐藥率最高，其次是SMZco、四環素和慶大霉素；多重耐藥率98.11%。159株志賀菌的多重耐藥率為89.94%。未發現對亞胺培南耐藥的菌株。見表2。

Tab.1 The PCR primer sequences表1 PCR反應引物

Tab.2 Antibiotic sensitivity of different serotype of 2009/2010 and 2013 years表2 2009、2010年及2013年組不同血清型藥敏結果

2.2 整合子分布及與耐藥性的關系 159株志賀菌中，1類整合子陽性的菌株數為118株（74.21%），2類整合子陽性的菌株數為89株（55.97%），1類、2類整合子均陽性的有70株。見表3。

Tab.3 Distribution of integrase in different serotypes表3 不同血清型整合酶攜帶情況 例（%）

2.2.1 1類整合子的分布 118株1類整合子陽性的菌株中，典型1類整合子23株，福氏志賀菌20株，宋氏志賀菌3株；非典型1類整合子95株，福氏志賀菌23株，宋氏志賀菌72株。典型1類整合子部分PCR擴增圖譜見圖1。

Fig.1 Electrophoresis of intI1/variable region/3'CS of typical class 1 integrons圖1 典型1類整合子intI1、可變區、3'CS基因擴增圖譜

典型1類整合子可變區共有5種基因盒：氨基糖苷腺苷酰基轉移酶A2（aadA2）、aadA1、二氫葉酸還原酶Ⅰ（dfrⅠ）、blaoxa-10及 blaoxa-1。20株福氏志賀菌中，18株攜帶aadA1、dfrⅠ及blaoxa-10的基因盒；另2株攜帶aadA2、dfrⅠ及blaoxa-1的基因盒。3株宋氏志賀菌中2株攜帶aadA2+blaoxa-10+dfrⅠ，另1株攜帶aadA1+blaoxa-1+dfrⅠ。

對非典型1類整合子測序分析，表明此插入片段依次由intI1基因、attI位點以及2個基因盒組成，3'保守區部分被一段插入序列IS1所替代；經BLAST比較，兩個基因盒分別為blaoxa-1和aadA1。

2.2.2 2類整合子的分布 攜帶2類整合子的89株，福氏志賀菌21株，宋氏志賀菌68株。帶有dfrA1、耐鏈絲菌素（satl）及aadA1 3種基因盒；部分菌株PCR擴增圖譜見圖2。

Fig.2 Electrophoresis of intI2/variable region of class 2 integrons圖2 2類整合子intI2、可變區基因擴增圖譜

2.2.3 整合子與多重耐藥性的關系 intI1和（或）intI2陽性菌株中多重耐藥所占比例為90.65%，高于整合子陰性菌株的50%，差異有統計學意義（χ2= 23.34，P＜0.05）；其中intI1、intI2陽性菌株中多重耐藥菌株出現的比率分別為91.53%和94.38%。

2.3 插入序列共同區分布情況 對159株志賀菌進行插入序列共同區（ISCR1）擴增，未發現陽性擴增條帶。

3 討論

近年來由于抗生素的廣泛及不合理使用，細菌的耐藥問題越來越嚴重，細菌的多重耐藥現象隨之發生。研究表明，整合子作為可移動基因元件，能整合不同的耐藥基因盒表達出對抗菌藥物的耐藥甚至多重耐藥。目前，具有捕獲及表達外來基因能力的整合子系統越來越引起研究者的關注，尤其對多重耐藥性研究有著非常重要的意義［6-7］。

整合子的基本結構由5'保守末端（5'CS）、3'保守末端（3'CS）及兩者之間的可變區構成。可變區含有1個或多個基因盒。整合子含有1個編碼整合酶的基因（intI），1個重組位點attI和1個啟動子3個功能元件。這3個功能元件均位于整合子5'CS區。3'CS區則因整合子類型不同而異。在1類整合子中把intI1陽性、可變區陽性及3'CS陽性的稱之為典型1類整合子，只有intI1陽性的稱之為非典型1類整合子。有學者利用反向PCR方法在非典型1類整合子中擴增出基因盒片段［3］。臨床中出現多重耐藥與整合子對耐藥基因的積累是分不開的［8］。

本研究顯示，我院近年臨床分離的志賀菌對四環素、鏈霉素、氨芐西林和SMZco的耐藥較為嚴重（均在50%以上）；多重耐藥率89.94%。整合子檢出率高達86.16%（137/159）。可變區分別攜帶aadA2、blaoxa-10、dfrⅠ及satl等耐藥基因。在本實驗中1類、2類整合子陽性菌株中多重耐藥株所占比例高于整合子陰性菌株，表明1、2類整合子在志賀菌多重耐藥中起到重要作用，與文獻［9-10］的報道相似。部分1、2類整合子陽性的菌株未檢出可變區，可能的原因有：（1）整合子基因突變，即3'CS缺失；（2）可變區長度超過PCR的可擴增范圍［11］。

Stokes等［12］首次發現并報道在復合1類整合子中發現了稱作ISCR的DNA序列，此序列和許多耐藥基因緊密連接。ISCR不同于以往的插入序列，它是一種新型的可移動元件。近年來，國內外多位學者在大腸埃希菌、克雷伯桿菌、枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌等多種革蘭陰性菌中發現了ISCR1的存在，且與細菌的耐藥性有一定的相關性，但本文在對分離的志賀菌屬的研究中未發現ISCR1陽性菌株。

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（2014-06-18收稿 2014-11-14修回）

（本文編輯 魏杰）

Carriage rates of class 1，class 2 integrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their relationship with drug resistance

DONG Lijuan1，YANG Xian1，WANG Jun1，QI Wei1△，LYU Xing2，LIANG Fan3
1 Second Hospital of Tianjin Medical University Institute of Infectious Disease，Tianjin 300211，China；2 Tianjin Medical University General Hospital；3 Tianjin Children's Hospital
△Correspongding Author E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

Objective To explore carrying rates of class 1，class 2 integrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their connection with drug resistance.Methods Antibiotic sensitivities were detected by K-B disk diffusion in 159 clinical isolates.Total bacteria DNA was prepared through boiling the isolates and the DNA was then used as template for PCR amplification.PCR，ZSCR1 and sequencing analyse of integrons were applied to all of them.Results were compared by Blast and GenBank.Results Antibiotic sensitivity results showed that in the S.flexneri strains the incidence of resistance to tet?racycline and streptomycin were 88.68% and 81.13% in the S.flexneri strains while the incidence of resistant to chloram?phenicol and trimethoprim-sulfamethoxazol were both 56.60%，and the incidence of multidrug drug resistance was 77.36%.In the sonnei strains，the incidence of resistance to ampicillin，trimethoprim-sulfamethoxazo were 97.17% and 95.28%，83.96% and 76.42% respectively，and the incidence of multidrug resistance was 98.11%.Among all isolates，118 were class 1 integron positive，70 were class 2 integron positive and 89 were double positives.For those 118 isolates that are positive of class 1 integron，23 were typical while 95 weres atypical.The gene cassettes of typical class 1 integrons contains aadA2，aa?dA1，dfrⅠ，blaoxa-10 and blaoxa-1.IntI1，aadA，blaoxa-1 and IS1 were included in the gene cassetes of the atypical class 1 integrons.Class 2 integrons positive isolates carried gene cassttes which include dfrA1，satl and aadA1.No ISCR1 was found in any isolate.Integron carriage strains were closely associated with higher rate of multiple antibiobic resistance compared with the organisms without integrons（90.65%，50%，P＜0.05）.Conlusion Class 1 and class 2 integrons were widely existence in Shigella isolates and were related to the multidrug resistance.

shigella；integrons；drug resistance，microbiol；sequence common region

R378.25

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.018

1天津醫科大學第二醫院感染研究所（郵編300211）；2天津醫科大學總醫院；3天津市兒童醫院

董麗娟（1989），女，碩士在讀，主要從事志賀菌耐藥性方面研究

△E-mail：qiweiwyx@yahoo.com