志賀菌屬外排泵AcrAB-TolC及其調控基因突變與氟喹諾酮耐藥性的關系

楊賢，董利娟，祁偉△，程玉謙，呂星，梁帆

志賀菌屬外排泵AcrAB-TolC及其調控基因突變與氟喹諾酮耐藥性的關系

楊賢1，董利娟1，祁偉1△，程玉謙1，呂星2，梁帆3

目的 探討臨床分離耐氟喹諾酮志賀菌外排泵AcrAB-TolC基因及其調控基因marOR、acrR、soxS突變與耐藥性的關系。方法 使用K-B紙片擴散法篩選臨床耐藥菌，測定加入泵抑制劑羰基氫氯苯腙（CCCP）后萘啶酸、左氧氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）的變化，PCR擴增外排泵基因acrA、acrB及其調控基因marOR、acrR、soxS并測序。結果 159株志賀菌中共篩選出11株氟喹諾酮耐藥菌株；加入質子泵抑制劑后2株耐藥菌株對氟喹諾酮類抗菌藥的MIC下降；7株耐藥菌對氟喹諾酮類抗菌藥的MIC不變；2株耐藥菌對氟喹諾酮類抗菌藥的MIC上升。基因測序發現氟喹諾酮耐藥菌株外排泵AcrAB-TolC調控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT堿基缺失。結論 泵抑制劑可部分抑制外排泵的活性。marOR突變可能與志賀菌對氟喹諾酮類抗菌藥耐藥有關。

志賀菌屬；喹諾酮類；抗藥性，細菌；外排泵AcrAB-TolC；marOR；羰基氫氯苯腙

志賀菌屬是引起細菌性痢疾（菌痢）的主要病原菌，是發展中國家引起感染性腹瀉的主要致病菌，在衛生條件差的環境可能引起疾病暴發［1］。氟喹諾酮類抗菌藥作為人工合成藥物，具有抗菌譜廣、抗菌力強、結構簡單、給藥方便等優點，為治療菌痢的首選藥物。但隨著臨床的廣泛應用，已有耐氟喹諾酮的志賀菌出現。本研究采用基因擴增及測序技術，結合加入泵抑制劑前后耐藥菌最低抑菌濃度（MIC）的變化來探討外排泵系統在志賀菌耐氟喹諾酮類抗菌藥中的作用，以及外排泵調控基因突變對耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗菌株分離自2009年6月—2013年6月天津醫科大學第二醫院、天津市兒童醫院和天津醫科大學總醫院三所三級甲等醫院腸道門診就診患者的糞便，經常規生化及志賀菌多價血清鑒定為志賀菌屬，共159株，并通過志賀菌單價血清鑒定明確血清型。

1.2 實驗儀器 DNA擴增熱循環（PCR）儀（德國Eppendorf公司）、DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）。基因測序委托英濰捷基（上海）貿易有限公司完成。高壓蒸汽滅菌器（山東安得醫療科技有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養箱（上海市新苗醫療器械制造有限公司）、超凈工作臺（冰峰）、1/10 000電子分析天平（MettlerAE100）。

1.3 實驗藥物及試劑 志賀菌4種多價混合血清及分群血清均為寧波天潤生物藥業有限公司產品。諾氟沙星、萘啶酸、氧氟沙星、環丙沙星和左氧氟沙星標準品均購自中國藥品生物制品檢定所。藥敏紙片包括氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、慶大霉素、鏈霉素、四環素、萘啶酸、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復方新諾明（SMZco）、頭孢哌酮、氯霉素、米諾環素和紅霉素共17種，購自北京天壇生物制品研究所。泵抑制劑羰基氫氯苯腙（car?bonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）購自Sigma公司。水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。實驗引物設計參照參考文獻［2-3］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

Tab.1 PCR amplification primers and target fragments表1 基因擴增引物序列及產物片段大小

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗 抗生素藥物敏感實驗采用改良Kirby-Bauer（K-B）紙片擴散法，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922［4］。根據美國臨床實驗室標準化研究所CLSI/NC?CLS2012年版標準進行判讀。

1.4.2 血清鑒定 采用玻片凝集法，取一潔凈載玻片，兩側分別加一滴診斷血清及對照用生理鹽水。取新鮮培養菌落分別與血清及生理鹽水混合均勻，生理鹽水呈現均勻混濁，血清在1 min內出現澄清透明、凝集顆粒較多為陽性，反之為陰性。若對照出現凝集則考慮鹽水自凝。

1.4.3 志賀菌AcrAB-TolC及其調控基因的檢測與分析 煮沸法提取模板DNA。PCR擴增體系25 μL，Premix taq酶12.5 μL，去離子水8.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL。PCR循環參數參見參考文獻［1］。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。分別取PCR產物15 μL以及相應擴增基因上游引物10 μL進行純化與測序。測序結果經BLAST程序與GenBank志賀氏標準菌片段序列進行比對，分析其基因突變數量和突變位點。

1.4.4 DNA解旋酶（gyrA）和拓撲異構酶Ⅳ（parC）的檢測 檢測方法同1.4.3。

1.4.5 泵抑制劑干預實驗 配制泵抑制劑CCCP（最終濃度為25 μg/L）與倍比稀釋不同濃度的抗菌藥物肉湯混合液，同時配制不含CCCP的不同濃度抗菌藥物肉湯混合液，每個濃度取100 μL放入96孔板中相應孔內，并設置僅含等濃度CCCP肉湯混合液孔作為生長對照孔。將每株志賀菌制備成均勻懸液，經0.5麥氏標準液比濁一致，吸取400 μL，加入39.6 mL 0.9%氯化鈉溶液中，混合均勻，用微量接種器接種后于36℃孵育18 h。比較應用泵抑制CCCP前后菌株對抗菌藥物MIC值的變化，獨立重復4次。

2 結果

2.1 志賀菌血清學分型 159株志賀菌中宋氏志賀菌102株，福氏志賀菌57株。

2.2 藥敏結果 藥敏試驗篩選出8株氟喹諾酮敏感菌株和11株氟喹諾酮耐藥菌株，耐藥菌株中耐萘啶酸11株、耐環丙沙星7株、耐氧氟沙星6株、耐諾氟沙星4株和耐左氧氟沙星2株。

2.3 志賀菌DNA解旋酶（gyrA）和拓撲異構酶Ⅳ（parC）的檢測 11株耐藥菌和8株敏感菌均擴增出648 bp片段和469 bp片段，經測序比對證實為gyrA、parC基因，4株耐藥菌gyrA 83位突變（Ser→Leu）及parC 80位突變（Ser→IIe）；1株耐藥菌僅有parC（Ser→IIe），2株耐藥菌gyrA 205位苯丙氨酸缺失；4株耐藥菌gyrA和parC均未突變。

2.4 志賀菌外排泵基因及其調控基因的檢測 11株耐喹諾酮菌株中有1株基因缺失株，8株喹諾酮敏感菌株中4株基因缺失。因此，從10株耐喹諾酮類抗生素菌株和4株喹諾酮敏感菌株中分別擴增出1 131、510、604、1 100和800 bp長度的片段，見圖1。經測序比對證實為分別為acrA、acrB、marOR、soxS和acrR基因的擴增產物，在耐藥組有10例，在敏感組中有4例。基因檢測結果acrA、acrB、acrR 和soxS突變率低，而在氟喹諾酮耐藥菌株中marOR都存在第36、37、38、39位CATT堿基缺失。

Fig.1 Electrophoresis of PCR products圖1 基因擴增產物及電泳

2.5 質子泵抑制劑對氟喹諾酮類MIC的影響 2株耐藥菌和1株敏感菌對氟喹諾酮MIC下降，分別為1株耐藥菌對環丙沙星MIC由8 mg/L降為4 mg/L；1株耐藥菌氧氟沙星MIC由1 mg/L降為0.5 mg/L； 1株敏感菌對氧氟沙星的MIC由1 mg/L降為0.5 mg/L。2株耐藥菌對左氧氟沙星的MIC由2 mg/L上升為4 mg/L。7株耐藥菌株和7株敏感菌對氟喹諾酮類抗菌藥的MIC不變。

3 討論

自1962年喹諾酮藥物人工合成以來便應用治療菌痢，隨著臨床的廣泛應用，志賀菌對此類藥物產生了耐藥性，耐氟喹諾酮藥物志賀菌的出現意味著對目前的經驗用藥治療策略提出挑戰［5］。志賀菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制是由于gyrA和parC的突變［6］，但外排機制在革蘭陰性菌的多重耐藥性中也起著重要作用［7］。志賀菌中的AcrAB-TolC外排泵屬于RND家族［8］，能外排青霉素、頭孢菌素、氟喹諾酮類、大環內酯類、氯霉素、四環素、新生霉素、夫西地酸、唑烷酮類、利福平等抗菌藥，主要受acrR、marOR和soxS調節。臨床分離大腸埃希菌多重耐藥與marA過量表達有關，marA能上調多重耐藥泵的表達［9-10］。大腸埃希菌marA基因是marRAB的組成成分之一，它是固有多重耐藥的全局調節子，而且marA或marA類似調控因子在沙門菌、志賀菌、肺炎克雷伯菌、鼠疫耶爾森菌及其他腸桿科、奈瑟菌和金黃色葡萄球菌中廣泛存在［11］。marOR突變可使marA的轉錄去阻遏產生大量MarA，MarA與acrAB啟動子附近DNA結合位點結合，增強啟動子與RNA聚合酶的親和力，加快轉錄率產生大量的acrA和acrB，也以同樣的方式促進TolC的表達，產生耐多藥細菌。本研究中11株氟喹諾酮耐藥株泵調控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT堿基缺失，這與任靜朝等［2］報道相同。在加入泵抑制劑CCCP后，AcrAB-TolC缺失株MIC下降可能是由于菌株中存在AcrAB-TolC以外的質子泵，而CCCP為廣譜質子泵抑制劑，抑制其他質子泵后MIC下降。存在AcrAB-TolC外排基因而MIC值無變化的菌株可能是泵基因未表達或外排泵活力低或外排泵對質子泵抑制劑不敏感。2株耐藥菌分別對氧氟沙星和左氧氟沙星MIC值升高，與Ruiz等［12］報道相同，該研究對此現象的解釋為：當大腸埃希菌AcrAB-TolC外排泵被抑制或失活時泵的外排底物如腸桿菌素、胱氨酸和嘌呤、半乳糖在細菌內積累量增加，從而使AcrR失活和（或）soxS和marA表達增多，最終使acrAB過量表達導致外排泵AcrAB-TolC外排作用增強，達到菌內穩態，從而導致MIC增高。本實驗中受試菌株在加入CCCP后，僅少數菌株MIC值小幅度下降，大多數無變化甚至上升，說明本實驗中受試菌株外排泵系統在氟喹諾酮耐藥機制中起的作用較小，其主要耐藥機制仍是gyrA和parC的突變。

外排泵基因acrAB在耐藥菌株中普遍存在，多數細菌具有主動外排作用，CCCP能部分抑制細菌的主動外排作用。本實驗菌株MIC下降倍數不等，說明主動外排作用對菌株耐藥性產生的貢獻不同。

［1］Pichel M，Brengi SP，Cooper KL，et al.Standardization and interna?tional multicenter validation of a PulseNet pulsed-field gel electro?phoresis protocol for subtyping Shigella flexneri isolates［J］.Food?borne Pathog Dis，2012，9（5）:418- 424.doi:10.1089/ fpd.2011.1067.

［2］Ren JC，Duan GC，Song CH，et al.Relation of acrAB-tolC efflux pump and marOR regulatory gene mutation with antimicrobial resis?tance in Shigella.spp［J］.Jorunal of Jilin University，2010，36（1）：45-48.［任靜朝，段廣才，宋春花，等.志賀菌主動外排泵AcrAB-tolC及調控基因marOR突變與耐藥的關系［J］.吉林大學學報，2010，36（1）：45-48］.

［3］Rahman M，Mauff G，Levy J，et al.Detection of 4-quinolone resis?tance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteria type 1 by PCR ［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38（10）:2488-2491.doi：10.1128/AAC.38.10.2488.

［4］Dong LJ，Yang X，Wang J，et al.Carriage rates of class 1，class 2 in?tegrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their relationship with drug resistance［J］.Tianjin Med J，2015，43（4）:400-403.［董利娟，楊賢，王俊，等.志賀菌1、2類整合子及ISCR1攜帶情況與耐藥性的關系［J］.天津醫藥，2015，43（4）:400-403］.doi:10.11958/ j.issn.0253-9896.2015.04.018.

［5］Azmi IJ，Khajanchi BK，Akter F，et al.Fluoroquinolone Rrsistance Mechanisms of Shgella flexneri Isolated in Bangladesh［J］.PLoS One，2014，9（7）:e102533.doi:10.1371/journal.pone.0102533.

［6］Yu J，Wang F，Ji WC，et al.Shigella Fluoroquinolone Drugs Re?search Progress of Drug Resistance［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2012，22（12）：3053-3054.［俞建，王飛，計文超，等.志賀菌氟喹諾酮類藥物耐藥的研究進展［J］.中國衛生檢驗雜志，2012，22（12）：3053-3054］.doi:1004-8685（2012）12-3053-01.

［7］Liu Y，Ou N.The Mechanism of Action of Quinolones Resistance Mechanism and Research Progress［J］.Pharmaceutical and Clinical Research，2014，22（2）：140-143.［劉楊，歐寧.喹諾酮類藥物的作用機制耐藥機制及研究進展［J］.藥學與臨床研究，2014，22（2）：140-143］.doi:1673-7806（2014）02-140-04.

［8］Yao MX，Yuan GY，Wen XM，et al.Active Efflux Pump System Me?diated the Research Progress of Multiple Drug-resistant in Bacteria ［J］.Modern Preventive Medicine，2014，4（1）：118-121.［姚明笑，苑廣盈，聞新棉.主動外排泵系統介導細菌多重耐藥的研究進展［J］.現代預防醫學，2014，4（1）：118-121］.doi:1003-8507（2014）01-0118-04.

［9］Ruiz C，Levy SB.Many Chromosomal genes modulate MarA-mediat?ed multidrug rwsistance in Escherichia coli［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（5）:2125-2134.doi:10.1128/AAC.01420-09.

［10］Shah AA，Wanq C，Chunq YR，et al.Enhancement of geraniol resis?tance of Escherichia coli by MarA overexpress［J］.Biosci Bioenq，2013，15（3）:253-258.doi:10.1016/J.Jbiosc.2012.10.009.

［11］Alekshun MN，Levy SB.Molecular mechanisms of antibacterial mul?tidrug resistance［J］.Cell，2007，128（6）:1037-1050.doi:10.1016/j.cell.2007.03.004.

［12］Ruiz C，Levy SB.Levy Regulation of acrAB expression by cellular metabolites in Escherichia coli［J］.J Antimicrob Chemother，2013，69（2）:390-399.doi:10.1093/jac/dkt352.

（2014-06-18收稿 2014-11-20修回）

（本文編輯 魏杰）

Relationship of AcrAB-TolC efflux pump and its regulatory gene mutation with fluoroquinolones resistance by Shigella.spp

YANG Xian1，DONG Lijuan1，QI Wei1△，CHENG Yuqian1，LYU Xing2，LIANG Fan3
1 Second hospital of Tianjin Medical University Institute of Infectious Disease，Tianjin 300211，China；2 Tianjin Medical University General Hospital；3 Tianjin Children's Hospital
△Correspongding Author E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

Objective To investigate the role of AcrAB-TolC efflux pump in fluoroquinolones resistance by Shigella.spp and to explore the significance of AcrAB-TolC efflux pump on mutation of acrR，soxS and marOR as well as on drug re?sistence.Methods Drug resistant bacteria were selected by Kirby-Bauer disk diffusion test.After addition of efflux pump inhibitor carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone（CCCP），change of minimal inhibitory concentration（MIC）s of nilidixic acid，Levofloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin and Norfloxacin were examined.The DNA binding region of acrA，acrB，soxS，acrR and marOR gene in these mutants were amplified by PCR and sequenced.Results Among the 159 clinical isolates of Shigella，11 strains are resistant to fluoroquinolone.After the addition of CCCP，MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains decreased；the MICs of 7 fluoroquinolone resistant strains did not change；MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains in?creased.The corresponding nucleotides C，A，T，T on the 36thto 39thof marOR gene were missing，showing by sequencing，in fluoroquinolone resistent strains which might be regulated by the efflux pump gene AcrAB-TolC.Conclusion Efflux pump inhibitor could restrain the activity of efflux partially.The mutations of marOR might play an important role in fluoroquino?lone resistent by shigella.

shigella；quinolones；drug resistance，bacterial；AcrAB-TolC efflux pump；marOR；carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone（CCCP）

R378.25

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.019

1天津醫科大學第二醫院感染研究所（郵編300211）；2天津醫科大學總醫院；3天津市兒童醫院

楊賢（1987），女，碩士在讀，主要從事志賀菌耐藥性方面研究

△E-mail：qiweiwyx@yahoo.com