純棉織物上黑曲霉胞內ATP提取方法探索

王志惠, 譚玉靜, 楊雪霞, 趙曙輝

(1. 東華大學 化學化工與生物工程學院, 上海 201620;2. 上海市質量監督檢驗技術研究院, 上海 200040)

純棉織物上黑曲霉胞內ATP提取方法探索

王志惠1, 譚玉靜2, 楊雪霞1, 趙曙輝1

(1. 東華大學 化學化工與生物工程學院, 上海 201620;2. 上海市質量監督檢驗技術研究院, 上海 200040)

細胞內三磷酸腺苷(ATP)的有效提取是利用ATP發光法檢測微生物數量的關鍵.為判斷霉菌在織物上的生長情況, 以純棉織物上接種的黑曲霉為對象, 研究了霉菌胞內ATP的提取方法，對比了加熱煮沸法、磷酸鹽緩沖液法、三氯乙酸法、二甲基亞砜法和苯扎溴銨(BAC)法共5種ATP提取方法對黑曲霉胞內ATP的提取效率.研究結果表明， BAC法提取ATP效果最好；BAC法提取的適宜條件：BAC質量分數為0.50%, pH值為12.0, 提取時間為5 min.相比于傳統的檢測法, 通過測定ATP含量判斷織物上霉菌生長的方法使檢測效率顯著提高.

純棉織物； 黑曲霉； 三磷酸腺苷(ATP)； 生物發光法； 提取條件

近年來, 國內織物防霉整理技術發展迅速, 建立快速準確的紡織品防霉性能檢測評價方法很有必要.現行的紡織品防霉性能評價方法主要是依據接種霉菌在試樣表面的生長情況來評價, 培養時間為28 d, 培養結束后根據霉菌生長面積進行分級.該方法不僅周期長, 而且霉菌生長程度及生長面積很難準確判斷, 實驗結果存在一定的偏差[1].因此, 探索一種快速準確的織物防霉性能檢測方法是非常必要的.

三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 是自然界各種生命活動中通用的能量載體, 是活細胞新陳代謝的一個指標, ATP的含量直接反映了細胞的數量和細胞代謝活力.ATP生物發光法是近年來開發出的一種通過檢測細胞內ATP含量來反映微生物的生長情況或數量的方法.該方法的原理: 熒光素作為可被氧化的底物, 在鎂離子存在的條件下, 與熒光素酶和ATP結合形成熒光素酶-熒光素-單磷酸腺苷(AMP)的復合物, 該復合物再與氧結合發出熒光[2-3].用方程式表達如下:

蟲熒光素+AMP +CO2+光能

在一定濃度范圍內, ATP的濃度與發光強度呈線性關系[4].ATP生物發光法具有簡便、快速、高靈敏度等特點，已廣泛應用于食品、醫療衛生、環境等領域的微生物檢測[4].目前國外已將ATP生物發光法用于抗菌織物抗菌效果的評價[5], 我國尚未建立利用ATP發光法進行紡織品防霉整理的檢測方法.

利用細胞內ATP含量進行微生物檢測時, 細胞內ATP的提取是關鍵.自ATP生物發光法應用于微生物檢測以來, 人們對微生物細胞內ATP提取方法進行了較多的探索，目前主要集中在細菌細胞, 對從霉菌細胞內提取ATP的方法研究較少.由于霉菌和細菌在細胞壁和細胞膜組成結構上差別較大, 有必要探索針對霉菌細胞內ATP的提取方法.據報道, 加熱煮沸法、磷酸鹽(PBS)緩沖液法[6]、二甲基亞砜(DMSO)法[7]、三氯乙酸(TCA)法和苯扎溴銨(BAC)法[8]均已應用于細菌ATP提取中.本文以在棉織物上接種的黑曲霉為對象, 選用上述5種方法評價ATP的提取效果, 為建立織物的防霉檢測方法提供參考.

1　材料與方法

1.1材料及儀器

材料: 黑曲霉ATCC-6275,美國菌種保藏中心;國家標準貼襯織物(棉GB/T 7568.2—2008),上海市紡織工業技術監督所；ATP生物發光試劑盒(含ATP標準品),蓋寧生物科技(北京)有限公司.

儀器：ATP快速檢測儀,北京濱松光子技術股份有限公司.

1.2實驗方法

1.2.1試劑配制

(1) 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(TE緩沖液):分別用去離子水配制10 mmol/L的Tris-HCl溶液和1 mmol/ L的EDTA, 調節pH值為8后等體積混合,121 ℃滅菌20 min.

(2) 沙氏液體培養基(SDB培養基):10 g/L胰蛋白胨, 20～40 g/L葡萄糖, pH值為5.6±0.2, 121 ℃滅菌20 min.

(3) PBS緩沖溶液:稱取2.84 g磷酸氫二鈉與1.36 g磷酸二氫鉀,配制成1 L溶液, 并調節pH值為7.2～7.4,121 ℃滅菌20 min.

1.2.2孢子懸液的制備

接種黑曲霉的斜面培養至孢子長出, 加入5～8 mL無菌生理鹽水, 用接種環刮取斜面上的孢子, 洗出的孢子液倒入裝有玻璃珠的三角瓶中.充分振蕩三角瓶將孢子分散,用滅菌的濾紙過濾后得到孢子懸液.用血細胞計數板測定孢子數量,稀釋孢子懸液使孢子含量為1×106～5×106個/mL.

1.2.3紡織樣品的準備及接種

稱取(0.20±0.02) g的純棉織物, 并剪成適當大小置于30 mL樣品瓶中滅菌, 防止其他霉菌或細菌的生長.

將黑曲霉孢子懸液用SDB培養基稀釋至適當濃度后, 吸取0.2 mL均勻接種于樣品瓶中的布樣上, 蓋好瓶蓋,在(25±2) ℃下培養(48±2) h.

1.2.4ATP提取方法

(1) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL于100 ℃下預熱的生理鹽水,混合均勻后加熱煮沸3 min, 冰浴降溫至室溫.

(2) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL的PBS緩沖溶液,混合均勻后加熱煮沸3 min, 冰浴降溫至室溫.

(3) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL在100 ℃下預熱的90%的DMSO,混合均勻后加熱煮沸1 min, 冰浴降溫至室溫.

(4) 樣品瓶中先加入0.8 mL生理鹽水,再加入質量分數為3.0%的TCA溶液1 mL,置于漩渦振蕩儀上振蕩3 min, 加入3 mL的TE緩沖液稀釋.

(5) 樣品瓶中先加入0.8 mL生理鹽水,再加入質量分數為0.05%的BAC溶液1 mL,置于漩渦振蕩儀上振蕩3 min, 加入3 mL的TE緩沖液稀釋.

1.2.5提取劑溶液pH值的優化

配制質量分數為0.05%的BAC溶液, 用HCl和NaOH調節pH值分別為1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0以及13.1, 并按照BAC法提取黑曲霉ATP.

1.2.6提取劑濃度的優化

分別配制質量分數為0.01%, 0.05%, 0.20%, 0.30%, 0.40%, 0.50%, 0.60%, 0.70%和0.90%的BAC溶液,調節pH值為12±0.1, 按照BAC法進行黑曲霉ATP的提取.

1.2.7提取時間的優化

配制質量分數為0.50%的BAC溶液,調節pH值為12±0.1.向培養好的樣品中加入0.8 mL生理鹽水和1 mL的BAC溶液后, 分別在漩渦振蕩儀上振蕩0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 min, 加入TE緩沖液稀釋.

1.2.8黑曲霉ATP發光值的測定

2　結果與討論

2.1提取方法對ATP提取效果的影響

因不同微生物細胞壁和細胞膜的成分不同, 其胞內ATP的最適提取方法也不同.實驗采用5種方法提取純棉織物上生長的黑曲霉細胞內的ATP, 黑曲霉的接種濃度設為3個梯度, 孢子含量分別為1×105, 1×106和1×107個/mL, 探尋黑曲霉胞內ATP的適宜提取方法.所得ATP含量通過ATP發光法測量的發光值來判斷, 以橫坐標為孢子含量的對數值, 縱坐標為ATP發光平均值(U)的對數值作圖, 實驗結果如圖1所示.從圖1可看出, 3種孢子接種濃度下, 加熱煮沸法提取ATP的效率均為最低.加熱煮沸法提取ATP的原理是利用高溫的作用將細胞破碎,同時使細胞內的ATP水解酶失活[6,9],由于加熱破壁效果有限,導致提取ATP效果最差.DMSO法與PBS緩沖液法提取ATP效果相近.DMSO對黑曲霉細胞有破壞作用, 細胞結構破壞后釋放出ATP[7].PBS緩沖液法的提取原理與加熱煮沸法相似, 其通過緩沖體系的作用, 改變細胞壁及細胞膜的通透性, 因而提取效率有所提高.TCA法及BAC法目前廣泛應用于細菌ATP的提取,在本實驗中相對其他3種方法, 這兩種方法的提取效率也較高.TCA對活細胞有兩種作用：一是使細胞膜破裂從而釋放出ATP, 二是使ATP水解酶失活.由于TCA對發光反應體系中的熒光素酶活性具有一定抑制作用,因此檢測時需要進行大量的稀釋, 從而對實驗結果造成一定的影響[8,10].BAC作為季銨鹽表面活性劑的代表, 化學結構為

BAC分子中既有親水基團, 又有疏水基團, 在水中帶正電荷, 而黑曲霉細胞帶負電荷, 故BAC能夠吸附聚集在黑曲霉細胞表面,進而滲入細胞的內脂層和蛋白層,導致細胞內酶鈍化, 蛋白質變性聚集, 通透性改變, 微生物的代謝遭到破壞, 細胞內容物滲出, ATP隨之釋放.另外BAC的存在也有助于將黑曲霉孢子從布樣上清洗下來,使得提取的黑曲霉ATP含量增加, 因而發光值提高[11-12].從本實驗結果來看, TCA法和BAC法都適用于黑曲霉胞內ATP的提取.由于TCA法對熒光素酶的抑制作用,因而主要研究BAC法提取ATP的適宜條件.

圖1　提取方法對ATP提取的影響Fig.1　The effect of extract methods on ATP extraction

2.2pH值對BAC法提取ATP效果的影響

提取劑的pH值不僅影響黑曲霉細胞的結構, 而且影響ATP發光系統, 不同pH值下黑曲霉ATP的提取結果如表1所示.

表1　pH值對ATP提取的影響Table 1　Effect of pH value on ATP extraction

由表1可知, 在酸性條件下, 隨著提取液pH值的增大, ATP發光平均值逐漸增大, 當pH值達到4.0時, ATP發光平均值達到最大；pH值繼續提高, ATP發光平均值開始下降.當pH值大于7.0后, 隨著堿性的增強, ATP發光平均值逐漸增大, 當pH值為12.0時, ATP發光平均值達到最大值, 之后發光平均值開始下降.相對于pH值為4.0的酸性提取條件, pH值為12.0時ATP的發光平均值更高.采用BAC法提取ATP時,當酸性或堿性過強時, ATP發光平均值過低, pH值為13.1時, ATP發光平均值迅速下降到100以下.這一方面是由于極端的酸堿環境使ATP結構破壞,另一方面,過酸或過堿的條件會導致熒光素酶活性喪失[13].當提取液pH值偏中性時, 提取劑對細胞壁和細胞膜的破壞能力較小,使得ATP的提取效率較低,導致測得的發光平均值過低.因而pH值會顯著影響ATP的提取效果, BAC提取黑曲霉ATP的最佳pH值為12.0.

文獻[12]用兩種濃度的BAC進行研究, 確定了大腸桿菌ATP提取的最佳pH值為5.2.文獻[14]研究發現水體中微生物ATP的最佳提取pH值為7.7～8.0.由此表明, 不同菌種ATP提取的最佳pH值相差較大, 主要是由于不同微生物細胞壁及細胞膜的組成不同.

2.3BAC質量分數對ATP提取效果的影響

根據文獻報道,采用BAC法對細菌ATP提取的最佳BAC質量分數從0.05%到0.20%不等[12,15].為了得到BAC法提取黑曲霉時所用的最佳BAC質量分數, 測試了不同濃度BAC溶液在pH值為12.0、提取時間為3 min時的提取效果,結果如圖2所示.由圖2可看出, BAC的質量分數對ATP的提取有很大影響, 在BAC質量分數低于0.40%時, 隨著BAC質量分數的增大, 發光值也逐漸增大；當BAC質量分數為0.50%時, ATP發光值達到最高, 之后便開始顯著下降.BAC屬于陽離子型表面活性劑, 能夠作用于黑曲霉細胞壁和細胞膜, 使其通透性改變并釋放出ATP.另外, BAC的存在也有助于將黑曲霉孢子從布樣上清洗下來, 使得提取的黑曲霉ATP含量增加,因而發光值提高.當BAC質量分數過高時也會影響熒光素酶的活性,從而導致發光值降低.因此, BAC法提取黑曲霉ATP的最佳質量分數為0.50%.

圖2　BAC質量分數對ATP提取效果的影響Fig.2　The effect of mass fraction of BAC on ATP extraction

2.4提取時間對BAC法提取效果的影響

在ATP提取中, 提取時間短,則細胞內ATP提取不完全；提取時間長,會影響ATP分子的結構穩定性.另外，不同菌種提取時間差異較大, 一般提取時間為2～4 min[8,12,15].設定提取時間分別為1, 3, 4, 5, 6和8 min, 采用pH值為12.0、BAC質量分數為0.50%的溶液進行黑曲霉ATP提取,考察提取時間對ATP提取的影響, 結果如圖3所示.

圖3　提取時間對ATP提取效果的影響Fig.3　The effect of extraction time on ATP extraction

由圖3可看出,當提取時間為5 min時, 發光值達到最大.當發光值達到最大后,黑曲霉的ATP已經全部釋放,時間延長,ATP發光值反而降低.因此, BAC提取黑曲霉ATP的最佳時間為5 min.

3　結　語

本文選用5種方法用于棉織物上黑曲霉胞內ATP的提取,發現BAC法是最適宜的提取方法,該法提取ATP的最佳條件:BAC質量分數為0.50%, 提取液pH值為12.0, 提取時間為5 min.相比于現行的紡織品防霉檢測所采用的觀察霉菌在布樣表面生長覆蓋面積來判斷霉菌生長情況的方法, 本文的檢測方法一方面可以大大縮短檢測時間(常規法需要接種培養28 d后觀察布樣上的霉菌生長面積, 而ATP發光法在接種培養2 d后即可立即測量)，另一方面，能夠進行定量測試, 提高測試結果的準確度.

采用BAC法進行黑曲霉胞內ATP提取與其他提取方法相比, 其效率較高、操作簡便, 且對熒光素酶活性的影響較小.但ATP的提取過程中熒光素酶的活性易受pH值、鹽度以及金屬離子(如K+、 Mg2+、 Ca2+等)影響, 因而在實際提取中需要進行探索并注意操作, 防止上述因素對實驗結果造成影響.

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Extraction Methods of Intracellular ATP inAspergillusnigeron Cotton Fabric

WANGZhi-hui1,TANYu-jing2,YANGXue-xia1,ZHAOShu-hui1

(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology,Donghua University, Shanghai 201620, China;2. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200040, China)

Extraction of intracellular adenosine triphosphate(ATP)is the key of detecting the amount of microorganisms by ATP luminescence. In order to determine the growth of filamentous fungi on pure cotton fabric,Aspergillusnigerinoculated on the cotton fabric was chosen as the experimental mode to study the ATP extraction methods. Five ATP extraction methods were compared, including boiling method, phosphate buffer method, trichloroacetic acid method, dimethyl sulfoxide method and benzalkonium chloride (BAC)method. The results showed that BAC method was the best method among five extraction methods and optimal conditions included 0.50%(mass fraction) BAC, pH value 12.0 and 5 min extraction time. Compared to the traditional detection method, the testing efficiency by determining the amount of ATP to determine the growth of filamentous fungi was significantly increased.

cotton fabric；Aspergillusniger； adenosine triphosphate(ATP)；bioluminescent method；extraction condition

1671-0444(2015)03-0324-05

2014-10-10

上海市質量技術監督局科研資助項目(2013-22)

王志惠(1990—)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向為紡織品抗真菌檢測方法.E-mail:wangzhihui200803@163.com

譚玉靜(聯系人)，女，高級工程師，E-mail:xiaotan98@126.com

TS 117

A