網絡證候學——中醫證候學研究的新模式*

李　正，張　硯，王　瑩，楊凱倫，高　杉，李　琳，于春泉（天津中醫藥大學，天津300193）

網絡證候學——中醫證候學研究的新模式*

李正，張硯，王瑩，楊凱倫，高杉，李琳，于春泉
（天津中醫藥大學，天津300193）

證候是中醫辨證論治的重要環節，是當前中醫藥現代化研究的重點和難點，雖然應用現代科學技術開展了證候生物學基礎研究，但仍然面臨一些困難和局限。筆者因而提出“網絡證候學”的理論概念和技術路線，將網絡藥理學的理論模型和分析技術引入到中醫證候研究之中，為中醫證候學研究構建全新的研究策略和模式。文章從中醫證候學的研究現狀及需求分析，網絡證候學提出的背景及研究模式，網絡證候學在中醫痰瘀互結證研究中的應用等方面進行分析和論述。

網絡證候學；中醫證候學；病證結合；痰瘀互結證

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.02

清代醫家葉天士曾云：“醫道在乎識證、立法、用方，此為三大關鍵，一有草率，不堪司命。然三者之中，識證尤為緊要。”可見辨明證候是中醫臨床診療的關鍵。證候是中醫辨證論治的重要環節，是對疾病某個階段的病因、病位及病理性質的反映，并隨著機體的功能改變而呈動態變化［1］。中醫證候注重宏觀表征對機體狀態進行認知和分類，整體把握人體功能狀態是其優勢，然而也存在主觀性較大等局限，業內普遍認為證候有其共性的內在基礎。從西醫學角度科學揭示病證關系，闡明其生物學基礎，解決中醫臨床辨證難題，開展證候宏觀與微觀的深入系統研究，對于推動中醫藥現代化進程以及豐富現代醫學體系意義重大［2］。

但由于長期以來對中醫證候及其演變規律的生物學基礎認識不清，病證關系難以厘清，缺乏科學有效的實驗方法和研究模式，限制了中醫證候理論的發展和臨床療效的進一步提高。隨著系統生物學、網絡藥理學等現代科學技術在中醫藥領域的深度結合，已在中藥領域廣泛應用并取得了諸多進展，為中藥新藥研發提供了靶標篩選、優化和預測，在中醫證候學研究領域還處于探索階段。

因此，筆者提出“網絡證候學”的理論概念，將網絡藥理學的理論模型和分析技術引入到中醫證候研究之中，有助于揭示證候與疾病之間非線性、非靜態的復雜網絡關系，有助于挖掘蘊藏在臨床、實驗等大數據背后的規律和特征，為中醫證候學研究構建全新的研究策略和模式。筆者將從中醫證候學的研究現狀及需求分析，網絡證候學提出的背景及研究模式，網絡證候學在中醫證候學研究中的應用等方面進行論述。

1　中醫證候學的研究現狀及需求分析

中醫之“證”和西醫之“病”分別構成了兩大醫學體系的基石，病證結合是中醫證候學研究的重要模式。病證結合是將疾病概念體系與證候概念體系相結合研究疾病的發生發展規律，用于指導疾病防治［3］。中西醫分屬不同醫學體系，疾病概念相似，但理論基礎不同，分類亦不相同，因而病證結合研究多見“以證統病”或“以病統證”兩種形式，難以統一整合。

當前，不同學者應用系統論、信息論、耗散結構、協同論等方法對病證結合進行多角度、多層面的詮釋和探索，從不同側面取得了一些研究進展，為臨床診治提供了一些客觀依據。但其研究模式多為使用多元統計方法（如聚類分析、主成分分析、因子分析、典型相關分析、結構方程模型、隱結構模型等）對復雜問題進行線性簡化，既不能解決變量間的多重共線性和非線性關系，也有與實際問題脫節的可能［4-6］。病證結合研究的疾病與證候之間應是復雜的網絡關系，簡單線性關系不能真正反映其內涵實質。

隨著病證結合研究朝探索證候的生物學基礎方向不斷深入，系統生物學方法逐漸成為本領域的研究熱點。系統生物學綜合數學、計算機和生物學等多學科知識，在基因組、mRNA組、蛋白質組和代謝組等各個層面開展組學研究［7-11］。田道法等［12］應用AtlasTM反義DNA陣列法檢測了氣虛證模型大鼠鼻咽上皮細胞基因組A區基因表達譜；王光平等應用mRNA差異顯示技術研究了肝陽上亢證（化風證）與正常受試者的基因表達情況［13］；劉希成等［14］用質譜獲得差異蛋白的肽質量指紋圖譜，通過蛋白功能分析發現33種蛋白質的差異表達與腎陽虛證密切相關；陳家旭等［15］以慢性束縛法制作肝郁脾虛證候的應激大鼠模型，經NMR數據采集與分析發現正常組與模型組之間存在代謝產物譜的顯著差異。

通過組學數據的整合分析，為中醫病證結合的生物學基礎研究提供了大量的實驗數據，所建立的證候模型在一定條件下也具有特異性的生物學特征。然而，單一類型的組學研究雖然數據龐大，但仍屬于還原論的研究模式，難以反映中醫病證結合的復雜性及其內在規律。因此，中醫證候學研究，特別是中醫病證結合研究亟需建立一種符合復雜系統、網絡關系、多維度、多層次的研究方法。

2　網絡證候學提出的背景及研究模式

2.1網絡證候學提出的背景近年來，一方面中醫證候研究積累了大量的組學數據，如果還沿襲傳統研究模式（證候動物模型構建+組學基礎研究）會逐步走入數據泥沼，難以應用于中醫臨床診療。另一方面西醫對疾病的生物學基礎早已進行了大量研究，物質基礎和作用機制較為明晰，積累了海量的組學數據。中醫證候研究不能再低水平重復研究，而是需要加強中醫病證結合研究，打通“疾病”與“證候”的“最后一里路”。網絡藥理學的思維模式和技術手段將發揮巨大作用，為證候的生物學基礎研究直接共享西方最新科研成果搭建橋梁。

網絡藥理學認為疾病是機體應對病原誘導而引發復雜網絡調控的結果，治療需要發現藥物如何干預疾病的病理網絡，而非與疾病相關的個別基因，需要對多種基因及調節蛋白的干擾進而影響疾病網絡［16］。網絡藥理學的理論思想與中醫藥的整體觀和辨證觀十分契合，因而對中醫藥研究產生了深遠影響，主要包括基于網絡的疾病基因預測、中藥成分的靶標譜和藥理活性預測、藥物-基因-疾病的共模塊分析、中藥方劑多成分協同作用的大規模篩選、中藥方劑的配伍規律和網絡調節機制分析等［17］。李梢教授將中醫藥與網絡藥理學相結合，提出了“中醫證候與分子網絡相關”、“中藥方劑療效機制在于網絡調節”的假說，開展了清絡飲、六味地黃丸等方劑的藥效物質與作用機制等方面的研究［18］。程翼宇教授提出將來源于實驗與文獻的多層次多維度數據進行整合分析，既可以在生物網絡的基礎上解析中藥作用機制，又可以在網絡模型上詮釋中醫藥理論［19］。徐筱杰教授運用分子對接和復雜網絡分析技術研究治療慢性腎病中藥所含化學成分和靶標之間的相互作用，為快速篩選出治療慢性腎病中藥的有效成分群及其關鍵靶標提供研究方法［20］。

中醫證候學研究需要與網絡藥理學的理念和方法進行深入整合，豐富自己的研究領域和技術手段。因而，筆者提出“網絡證候學”的理論體系和研究模式，旨在通過復雜網絡技術挖掘證候與疾病在生物分子層面的關聯，進而通過“臨床和實驗”數據驗證和完善中醫證候網絡模型，發現中醫證候的靶標群并用于指導中醫臨床診療和創新藥物研發。

2.2網絡證候學的研究模式網絡證候學研究主要包括證候臨床研究、證候實驗研究和證候網絡研究3個方面，三者之間是相互協同影響的有機整體、缺一不可。證候臨床研究主要通過合理設計臨床分組，開展隊列對照研究，進行結局效應評價，并采集臨床生化和組學樣本；證候實驗研究主要通過構建相關證候的體外和體內模型開展生物學基礎研究，并對臨床生化和組學樣本進行檢測，驗證證候生物學基礎假設；證候網絡研究主要以文本挖掘或流行病調查方式發現病證關系、進而構建疾病子網絡和病證結合網絡，通過網絡計算分析對臨床和實驗研究進行預測和優化，并借助臨床和實驗數據對中醫證候網絡模型進行完善和驗證。網絡證候學研究模式如圖1所示。

2.2.1證候臨床研究證候臨床研究是網絡證候學研究的起始點和目的地，要從中醫臨床入手，解決中醫臨床問題，是網絡證候學的研究主線。證候臨床研究主要涵蓋研究場所、研究對象、納入標準、排除標準、樣本含量估計、干預實施規范、全要素觀察、前瞻性登記、患者依從性、臨床指標采集、數據管理與統計等方面。中醫證候臨床研究為認識證候的生物學基礎提供了最為重要的數據來源，數據的可靠性直接依賴于證候標準的準確界定。臨床生化、組學數據提供了連接中醫證候與生物分子作用網絡的橋梁。

2.2.2證候實驗研究證候臨床研究產生證候生物學基礎的科學假設，證候實驗研究則通過動物模型和細胞模型在具體機制上進行實驗驗證。證候實驗研究主要涵蓋證候動物模型構建，證候相關細胞實驗設計、組學分子機制研究等方面。證候實驗研究是網絡證候學研究的科學基礎和數據來源，要科學合理設計研究方案，為中西醫專家所接受，是網絡證候學的研究難點。

圖1　網絡證候學研究模式示意圖Fig.1 Illustration of the framework for network syndrome study

2.2.3證候網絡研究證候網絡研究是網絡證候學研究的核心方法和關鍵技術，要努力搭建中醫與西醫、臨床與實驗的溝通橋梁，是網絡證候學的研究特色。證候網絡研究主要涵蓋病證結合文本挖掘、疾病子網絡構建、病證結合網絡構建、網絡計算分析和預測、網絡模型完善和驗證等方面。證候網絡研究為證候的臨床數據和實驗數據提供一個分析、闡釋的工具和平臺，通過綜合分析證候、疾病、分子、生化等多方面信息，系統給出證候相關的生物通路及其相互作用關系。

證候網絡研究主要應用網絡構建、網絡分析工具如IPA、Cytoscape等生物信息軟件和自主開發的中醫證候網絡分析平臺進行網絡構建和研究。

3　網絡證候學在中醫證候學研究中的應用

筆者以冠心病痰瘀互結證為例開展網絡證候學示范研究，系統進行了冠心病痰瘀互結證的證候臨床研究、證候實驗研究和證候網絡研究，是國家重點基礎研究發展計劃（“973”計劃）課題“冠心病痰瘀互結證病證關系及其生物學基礎研究（2014CB542902）”的階段性總結。

以冠心病痰瘀互結證為實例開展中醫臨床辨證基礎的示范研究，有助于揭示冠心病痰瘀互結證的病證關系及其生物學基礎，對于充分發揮中醫藥防治心血管疾病的優勢，提高中醫藥臨床服務能力，改善民生，創新中醫藥現代科學體系，提升中醫藥國際競爭力，具有十分重要的現實意義和深遠的歷史意義。本研究立足“痰-脂質代謝紊亂、瘀-微循環障礙、痰瘀互結-炎癥介導”的假設，從宏觀到微觀開展冠心病痰瘀互結證的整體網絡調控異常研究，闡釋冠心病痰瘀互結證生物學基礎。以網絡證候學方法，探索冠心病痰瘀互結證宏觀與微觀結合多層次辨證方法，并通過方證對應驗證，為解決冠心病痰瘀互結證的臨床辨證難題提供理論基礎。

3.1冠心病痰瘀互結證的證候臨床研究選取冠心病痰瘀互結證、冠心病氣陰兩虛證，以健康人為對照，給與丹蔞片干預，開展隊列研究。檢測脂質代謝，炎癥介質，內皮細胞損傷，凝血功能等評價病證關系的生化基礎，檢測血漿代謝組學，SNP基因分型和全基因表達譜芯片，揭示與“痰-脂質代謝紊亂”、“瘀-微循環障礙”、“互結-炎癥介導”等系統相關的生物學基礎。

3.2冠心病痰瘀互結證的證候實驗研究借助載脂蛋白E（apoE）、內皮型一氧化氮化合酶（eNOS）基因敲除動物模型、細胞模型等模擬“痰、瘀、痰瘀互結”不同狀態開展實驗驗證，明確冠心病痰瘀互結證病證方對應關系。在網絡證候學指導下，從核因子（NF-κB）、白細胞介素-1（IL-1）、血清可溶性CD40配體（sCD40L）等入手，深入探討炎癥介質介導冠心病痰瘀互結證復雜網絡關系時空相證機治演變的網絡調控特征。

3.3冠心病痰瘀互結證的證候網絡研究首先通過文獻挖掘發現冠心病痰瘀互結證與脂質代謝紊亂、微循環障礙和炎癥反應等病理表現相關，并且發現與冠心病痰瘀互結證相關的疾病主要有：冠心病、冠狀動脈疾病、缺血病心臟病、血栓、高脂血癥、動脈粥樣硬化等。

使用IPA生物信息學軟件構建冠心病痰瘀互結證的疾病子網絡，包括疾病相關的基因、蛋白、通路等生物分子信息，如圖2所示。

圖2　冠心病痰瘀互結證疾病子網絡圖Fig.2 Subnetw ork of coronary hear td iseasew ith interm ingled phlegm and blood stasissyndrome

在冠心病痰瘀互結證疾病子網絡的基礎上構建冠心病痰瘀互結證病證結合網絡，如圖3所示。

通過對冠心病痰瘀互結證病證結合網絡進行節點度頻數分析，其中apoE、eNOS兩個基因靶點與實驗設計有較好的吻合度，預測環氧合酶［PTGS2（COX2）］靶點在痰瘀互結證臨床和實驗研究中應給予高度關注，如圖4所示。

圖3　冠心病痰瘀互結證病證結合網絡圖Fig.3 Netw ork of combination of disease and syndrome such as coronary heartdiseasewith interm ingled phlegm and blood stasis synd rome

圖4　冠心病痰瘀互結證病證結合網絡節點度頻數分析圖Fig.4 Frequency analysisof the node in the netw ork synd rome for coronary heart diseasewith interm ingled phlegm and blood stasissyndrome

4　討論

中醫證候學的現代研究從20世紀60年代興起的證候本質研究，到始于80年代的證候規范化研究，不同學者為揭示證候的科學內涵和規律進行了大量研究和探索，取得了《中藥新藥臨床研究指導原則》、《中醫病證診斷療效標準》、《中醫病證分類與代碼》、《中醫臨床診療術語》等諸多成果，但仍存在著診斷標準版本眾多、臨床指導較難應用、生物物質基礎不清等問題［21］。中醫病證結合研究是中醫證候研究的重要領域，嘗試溝通中醫、西醫兩大醫學體系，但受概念定義和疾病分類的干擾，病證難以結合。兩種醫學對疾病的認識各不相同，都植根于各自長期臨床診療的經驗總結，兩者必然具有相通的物質基礎，而網絡證候學是解決該問題的有效方法。

臨床辨證是基于證候臨床宏觀表征集合，關聯特定病理生理網絡調控異常過程，是對人體功能狀態多層次復雜關系及其演變規律的認知與分類［22］。當前，多學科特別是復雜科學、系統生物學的進展為證候研究提供了解決的可能，集成引入、應用、創新現代科學技術方法，有望實現證候臨床辨證基礎研究的實質性突破。復雜性科學被譽為是“21世紀的科學”，基本方法是定性判斷與定量計算相結合、微觀分析與宏觀綜合相結合、還原論與整體論相結合、科學推理與哲學思辨相結合。網絡證候學的提出，正是認識到證候與疾病在生物分子層面具有一定的一致性，通過復雜網絡分析技術，可以擺脫具體概念范圍的束縛，直接發現具有相關性的生物靶標群，并用于指導中醫臨床診療和創新藥物研發。

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（本文編輯：張震之，滕曉東）

Network syndromology-A new approach to studying the syndrome in traditionalChinesemedicine

LI Zheng，ZHANG Yan，WANGYing，YANGKai-lun，GAOShan，LILin，YU Chun-quan
（Tianjin University ofTraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

Syndrome isessential to the accurate diagnosisand effective treatments in the clinical practice of traditional Chinesemedicine（TCM）.However，itstill remainsa challenge in themodernization of TCM despiteof the research efforts thatwere put in to study the underlying biologicalmechanismsof TCM syndrome.Thereforewe propose in thispaper the conceptand technical roadmap ofnetwork syndromology to providea novel framework and strategy for studying TCM syndrome.We first introduced the currentstatusand future needs of TCM syndrome research.Then we discussed the background and technicalelementsofnetwork syndromology.A case study ofapplying network syndromology in elucidating the syndrome of intermingled phlegm and blood stasisin coronary heartdiseasewas illustrated asan examp le.

network syndromology；TCM syndrome；combination of disease and syndrome；intermingled phlegm and blood stasis syndrome

R2-03

A

1672-1519（2015）07-0388-05

國家重點基礎研究發展計劃（“973”計劃）項目（2014CB542902）。

李正（1976-），男，研究員，主要從事中藥網絡藥理學與中藥數字制藥技術研究。

于春泉，E-mail:ycq-4@163.com。

（2015-04-28）