抗腫瘤溶栓雙功能嵌合蛋白截短突變體

黃秋妮　鹿騰　謝良秋

摘 要：臨床研究顯示，腎細胞腫瘤、胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、肝臟腫瘤等腫瘤患者經常會出現靜脈血栓、彌散性血管內凝血、肺栓塞、游走性淺表血栓性靜脈炎、門靜脈血栓和動脈血栓栓塞等血栓栓塞性疾病。腫瘤發生與血栓形成的關系極為密切，血栓的形成在腫瘤轉移、腫瘤血管生成機制中起著重要作用，而血栓又會加大癌癥的發病率和死亡率。

關鍵詞：惡性腫瘤；葡萄球菌激酶

金葡球菌腸毒素C2（staphylococcal enterotoxins，SEC2）是由金黃色葡萄球菌產生的一類超抗原，極低濃度下即可刺激大部分的T細胞增殖，使之釋放多種細胞因子，產生強烈的免疫應答反應和顯著的腫瘤抑制作用，臨床上應用與肺癌、直腸癌、肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤的治療。葡激酶（staphylokinase ，Sak）是典型的第三代溶栓藥物代表，與傳統溶栓藥物相比，葡激酶具有纖維酶原激活能力強的特點，并且免疫原性低，特異性高、過敏反應少，是目前相對較可靠和安全的心血管疾病治療呢藥物。

基于SEC2的廣譜抗腫瘤活性和Sak的高效溶栓作用，構建嵌合蛋白SEC2-linker-Sak和Sak-linker-SEC2。實驗中對SEC2和Sak都進行了必要的處理，可以說進行嵌合的SEC2是一種截短突變體，降低毒性和分子量，Sak也是一種不改變功能的突變體，進行此操作方便于構建嵌合體更好的在臨床其作用。

1 惡性腫瘤并發血栓

惡性腫瘤并發血栓機制是惡性腫瘤相關的炎癥可以導致凝血因子Ⅷ、纖維蛋白原等急性期蛋白濃度增加，從而增加血栓形成的風險。血栓是惡性腫瘤的征兆，研究發現大多癌癥患者的凝血系統都被激活了，而凝血酶能夠促進腫瘤細胞生長，轉移和侵襲，并且還能促使腫瘤血管新生。

2 惡性腫瘤并發血栓的治療

腫瘤患者并發血栓或者疑似血栓時，無需確診應立即進行抗凝治療。目前臨床上的抗凝藥物多用低分子量肝素（LMWH）治療10-14天，然后采用口服華法林治療。由于口服華法林的效果較慢，并且在給藥初期常常出現高凝狀態，所以必須與肝素同時給藥5-7天直到達到預期抗凝水平。腫瘤并發血栓的患者接受LMWH治療后仍有高達9%的患者會出現血栓復發，肝素易引起血小板減少，因而不能持續給藥。20%的接受華法林治療患者會復發血栓，但一般不推薦增加華法林用藥強度，因為增加華法林用藥會增加出血的風險，并且不能減少血栓復發。

3 金黃色葡萄球菌腸毒素C2

3.1金黃色葡萄球菌腸毒素C2 （Staphylococcal enterotoxin C2， SEC2）

作為超抗原目前已普遍應用于抗腫瘤治療，在中國臨床應用最早的為沈陽協和生物制藥公司開發的高聚生，其有效成分為金黃色葡萄球菌腸毒素C2。根據臨床療效觀察，其確實起到了提高機體免疫力，減輕放化療引起嘔吐等腸道副反應，升高白細胞數量，消除惡性腹水，預防腫瘤復發和轉移的作用，并且療效顯著，未見嚴重副作用，尤其與放療或化療聯用效果更好。

SEC2對腫瘤細胞的殺傷作用主要體現在以下幾個方面：

1） SEC2可以活化T細胞，直接殺傷表達MHC-11的腫瘤細胞，并且對不表達MHC-11的腫瘤細胞也可以產生一定的作用

2）被SEC2活化的T細胞可以分泌產生大量具有生物活性的細胞因子，包括IL-1， H--2， TNF-a ， IFN-仔口TNF-p等，這些細胞因子可以進一步活化l`}K細胞或者促進腫瘤細胞表達MHC-11，從而產生直接和間接的腫瘤細胞殺傷和抑制。

3.2 SEC2突變體

大量的實驗結果顯示，SEC2作為一種外源性超抗原，可以強烈地抗腫瘤，顯然為腫瘤治療提供了新想法。但是，SEC2真正用于臨床抗腫瘤還存在著許多問題。首先，SEC2作為潛在的胃腸毒素，可引發嘔吐，腹絞痛、嚴重腹瀉等毒負反應。其次，作為潛在的抗腫瘤藥物，SEC2是一種外源蛋白，分子量較大（由239個氨基酸殘基組成，分子量大約27.6 kDa），不易于靜脈注射和人體吸收，并能引起過敏反應。基于以上兩點，SEC2的臨床應用受到了很大限制。根據SEC2的晶體結構分析功能分析，確認從N端Gly 19起為SEC2的TCR結合位點，為保留其超抗原性，利用分子生物學技術，分別截去了SEC2 N端17個氨基酸殘基與C端132個氨基酸殘基，獲得了去除毒副作用，保留超抗原性的超抗原小分子肽，并且其分子量大大降低。

4 金黃色葡萄球菌激酶

4.1 Sak及溶栓作用機制

葡激酶（staphylokinase， Sak）系由具有溶原性的金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外蛋白，具有溶栓的特性。分泌成熟的Sak為136個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量約為15 kD，分子內沒有半膚氨酸，不含有二硫鍵。Sak本身并不是一種酶，不能直接使纖溶酶原轉變為纖溶酶，它的活性是指其對纖溶酶原的激活效力而言的。Sak激活纖溶酶原的機制與鏈激酶相似，通過激活纖溶酶原（Plg）轉變成纖溶酶（Plm），從而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓藥物。

4.2 Sak缺失突變體

研究報道葡激酶蛋白N端十幾個氨基酸對纖溶酶原的激活無作用，利用現代分子生物學技術，得到N端缺失10個氨基酸的葡激酶缺失突變體，獲得溶栓活性不變的葡激酶蛋白

5 突變體嵌合以及活性測試

從pET28a-sec2中PCR獲得sec2基因片段，并將sec2插入載體

pET28a-sak，構建載體pET28a-sec2-linker-sak，將得到的載體pET28a-sec2-linker-sak經PCR去除sec2和sak之間的linker，平末端連接后轉化大腸桿菌BL21 （ DE3 ）。轉化子經酶切和測序確認得到表達載體pET28a-sec2 -Sak。將重組大腸桿菌接種于含40 [g/ml卡那霉素LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度值達到0.6時，在30℃條件下用1mM IPTG誘導4-5小時，之后離心收集菌體細胞。用超聲波破碎菌體細胞，10000 rpm離心10 min，去除不溶性細胞碎片，收集上清液，將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白His-SEC2-Sak。嵌合蛋白His-SEC2-Sak經過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白SEC2-Sak。同樣的方法制備嵌合蛋白Sak -SEC2 。經實驗驗證所構建的突變蛋白嵌合體具有體外抗腫瘤的作用，且具有體外溶血栓的功能。

參考文獻

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