酮康唑對大鼠鼻腔和灌胃給予咪達唑侖及其代謝產物藥動學差異的影響

王 娟，王曉英，李敬來，李 崢，鄭愛萍，張振清，莊笑梅（抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

酮康唑對大鼠鼻腔和灌胃給予咪達唑侖及其代謝產物藥動學差異的影響

王 娟，王曉英，李敬來，李 崢，鄭愛萍，張振清，莊笑梅
（抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的在系統比較大鼠鼻腔和灌胃給予咪達唑侖藥動學特征的基礎上，進一步比較酮康唑對2種給藥途徑藥動學的影響。方法 24只大鼠隨機分為4組，每組6只。其中2組分別經鼻腔或灌胃只給予咪達唑侖（1 mg·kg-1），另外2組聯用細胞色素P450酶3A（CYP3A）抑制劑酮康唑（30 mg·kg-1）后再分別經鼻腔或灌胃給予咪達唑侖，不同時間點采集血樣，測定咪達唑侖和1′-羥基咪達唑侖濃度，計算藥代動力學參數，并進行統計學分析。結果 大鼠單獨經鼻腔和灌胃給予咪達唑侖后，原型藥物的達峰時間（Tmax）分別約為2和25 min，藥時曲線下面積（AUC）分別為296和179 μg·L-1·h。合用酮康唑后，在鼻腔和灌胃給藥條件下，咪達唑侖原型藥物在大鼠體內的AUC分別增加到原來的2.1和3.3倍。但是，酮康唑不改變咪達唑侖鼻腔給藥的Tmax，而合用酮康唑后，咪達唑侖灌胃給藥的Tmax延長至1.14h。結論 咪達唑侖經鼻腔給藥與經口服給藥相比，吸收迅速、藥物暴露量大，更適合于臨床急救。咪達唑侖經鼻腔給藥合用酮康唑后，不改變吸收速度，但抑制其代謝轉化，藥物體內駐留時間明顯延長；咪達唑侖口服給藥合并給予酮康唑后，吸收減慢，抑制代謝轉化，體內藥物暴露量明顯增加。由于咪達唑侖的中樞鎮靜作用，2種途徑合用酮康唑時均應考慮適當減少給藥劑量或延長給藥間隔。

咪達唑侖；酮康唑；藥代動力學；藥物相互作用

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.010

癲癇發作是臨床急危癥之一，需要立即搶救，若不及時控制可造成腦組織神經系統的不可逆損害，嚴重時可危及生命。盡早控制驚厥持續發作是挽救生命改善預后的關鍵［1］。咪達唑侖（midazolam，MDZ）為環狀結構的苯二氮卓艸類化合物，是一種新型苯二氮卓艸類藥物，具有抗焦慮、肌松、鎮靜和催眠等作用，作為麻醉劑廣泛應用于臨床［2］。后來在動物實驗中發現，其具有顯著的抗驚厥作用，特別是當驚厥不能為地西泮、苯妥英鈉和苯巴比妥所控制時MDZ仍然有效。MDZ不但能成功地控制驚厥發作，而且能夠有效地消除發作間期癇樣放電［3］。MDZ是細胞色素P450酶3A（cytochrome P-450 3A，CYP3A）的經典底物，人體內主要產物為1′-羥基咪達唑侖（1′-OH-MDZ）；大鼠體內產物除了1′-OH-MDZ外，還有4-OH-MDZ。1′-OH-MDZ的活性約為MDZ的1/10［4］。因此，原型藥物暴露量的變化是藥效改變的決定性因素。

雖然MDZ對驚厥和癲癇的穩定療效已受到臨床醫師的廣泛認可，鼻腔給藥途徑也是臨床常用的途徑［5］，但MDZ經鼻腔給藥和口服給藥的藥代動力學差異未見報道。CYP3A介導的藥物相互作用是否會因給藥途徑不同而不同也值得探索。本研究的目的包括：①系統比較大鼠鼻腔或ig給予MDZ后，原型藥物及1′-OH-MDZ的藥動學特征及差異；②合用CYP3A抑制劑酮康唑（ketoconazole，KTZ）后，觀察KTZ對MDZ經以上2種途徑給藥后，體內藥動學差異的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

MDZ鼻噴劑（25 g·L-1，批號20121119-1），由軍事醫學科學院毒物藥物研究所藥物制劑研究室提供；MDZ注射液（5 g·L-1，批號20110802），購自江蘇恩華藥業股份有限公司。MDZ標準品（純度＞99%，批號MD101102），宜昌人福藥業有限責任公司；1′-OH-MDZ標準品（純度＞99%），美國BD Gentest公司；KTZ標準品（純度＞98%，批號SLBG3774V）美國Sigma公司；內標鹽酸苯環壬酯（8021）（批號010626，純度99.8%），白色粉末，由軍事醫學科學院毒物藥物研究所藥物化學合成室提供；乙晴和甲醇，色譜純，購于Fisher Scientific（中國）公司；實驗用水為娃哈哈純凈水，娃哈哈集團有限公司；甲酸，分析純，北京化學試劑公司；氯化鈉注射液（0.9%），山東華魯制藥有限公司。

1.2 儀器

美國Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液質聯用系統（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。控制軟件為Xcalibur1.4，質譜數據分析采用Lcquan2.0數據處理系統。色譜柱，BetaBasic-18（50 mm× 2.1 mm，5 μm，Thermo Electron Corporation，美國）。

1.3 動物及分組處理

成年SD大鼠24只，雌雄各半，體質量為180～220 g，由軍事醫學科學院動物中心提供，動物合格證號：SYXK-（軍）2011-0010。

24只大鼠隨機分為4組，每組6只，雌雄各半。Ⅰ組：ig給予KTZ（30 mg·kg-1）30 min后，再給予MDZ鼻噴制劑（1 mg·kg-1）；Ⅱ組：ig等量的溶媒30 min后，給予MDZ鼻噴制劑（1 mg·kg-1）；Ⅲ組：ig給予KTZ（30 mg·kg-1）30 min后，再ig給予MDZ溶液劑（1 mg·kg-1）；Ⅳ組：ig等量的溶媒30 min后，再ig給予MDZ溶液劑（1 mg·kg-1）。分別于給藥前和給藥后2，5，10，15，20，30，45 min，1，2，3，4，6，8 和24 h，由眼眶靜脈取血約0.2 mL，置于含有肝素的抗凝試管中，離心（3500×g，4℃）15 min分離血漿，準確取血漿0.05 mL 2份，置-80℃冰箱凍存備測。隨行標準曲線濃度范圍：MDZ 2.0～2000.0 μg·L-1，1′-OHMDZ 0.2～200.0 μg·L-1。含MDZ/1′-OH-MDZ濃度為4.0/0.4，100.0/10.0，1500.0/150.0 μg·L-1的大鼠空白血漿樣品作為質控樣品。

1.4 色譜條件

流動相組成：水∶乙腈（含0.1%甲酸）=85∶15 （V∶V）。流速為0.45 mL·min-1，進樣量10 μL，運行時間為4.5 min，柱溫25℃。

1.5 質譜條件

選擇大氣壓化學電噴霧源（ESI），鞘氣45 psi，輔助氣12 psi，噴霧電壓4800 V，溫度320℃，源內碰撞誘導裂解（in-source CID）-10 V。MDZ，1′-OH-MDZ和內標檢測的質荷 比（m/z）分別為326.1，342.1和358.0。以選擇性反應離子（SRM）方式在正離子模式下檢測m/z 326.1的碎片離子為m/z 222.0；m/z 342.1的碎片離子為m/z 168.0；m/z 358.0的碎片離子為m/z 156.0。

1.6 血漿樣品處理和測定

血漿樣品0.05 mL加入0.1 mL內標（500 μg·L-1，溶劑為乙腈）和乙腈0.05 mL，渦旋1 min，離心（12 000×g，4℃）10 min，取上清0.15 mL于進樣瓶內，進樣分析。

1.7 數據處理及統計學分析

采用Winnolin藥代動力學程序對所測數據進行c-t曲線擬合，以非房室模型（統計矩法）計算主要藥代動力學參數：藥物峰濃度（cmax）、藥時曲線下面積（AUC）、達峰時間（Tmax）、半衰期（t1/2）和平均駐留時間（MRT）。采用SAS統計軟件對各組參數進行雙側成組t檢驗。

2 結果

2.1 同時測定大鼠血漿中MDZ和1′-OH-MDZ的LC-MS/MS方法驗證

MDZ、1′-OH-MDZ和內標的色譜峰（典型色譜圖略）均尖銳對稱，且分離度良好，血漿中內源性物質不干擾樣品的分離測定，該方法具有較高的專屬性。MDZ的大鼠血漿定量范圍在2.0～2000.0 μg·L-1內時，呈良好的線性關系，回歸方程為Y（Ai/As）=0.008+ 0.009X（Ci），相關系數的平方γ2為0.9928，定量下限為2.0 μg·L-1，1′-OH-MDZ的血漿定量范圍在0.2～200.0 μg·L-1內時，呈良好的線性關系，回歸方程為Y（Ai/As）=-0.0007+0.0057X（Ci），相關系數的平方γ2為0.9961，定量下限為0.2 μg·L-1。MDZ/1′-OH-MDZ濃度為4.0/0.4，100.0/10.0，1500.0/150.0 μg·L-1的質控樣品在大鼠血漿中的回收率均在93.9%以上；批內和批間的精密度分別在13.2%和13.0%以內；其準確度控制在89.3%和106.1%以內；MDZ和1′-OH-MDZ的基質效應影響范圍分別為72.4%～80.3%和111%～128%，大鼠血漿對MDZ和1′-OHMDZ的基質效應出現了較明顯的抑制和增強，但由于變異較小（RSD在3.9%～9.8%之間），不影響樣品定量準確性［6］。以上驗證結果說明，該方法滿足生物樣品定量檢測要求。

2.2 大鼠經鼻腔和灌胃給予MDZ后藥代動力學特征比較

大鼠經鼻腔和灌胃給予MDZ后，原型藥物及代謝產物1′-OH-MDZ的藥時曲線見圖1，相應的藥代動力學參數見表1。

Fig.1 Mean plasma concentration-time profiles of midazolam（MDZ）（A）and 1′-hydroxymidazolam（1′-OHMDZ）（B）after intranasal administration and ig of MDZ （1 mg·kg-1）in rats.±s，n=6.

表1結果顯示，MDZ（1 mg·kg-1）經鼻腔給予大鼠后，原型藥物被吸收入血的速度明顯快于ig給藥，cmax也明顯高于ig給藥，雖然AUC未顯示統計學差異，但也是ig給藥的1.6倍左右。此外，與ig給藥相比，MDZ經鼻腔給藥在大鼠體內的代謝率降低，AUC（1-OH-MDZ）/AUC（MDZ）比值在鼻腔給藥時為16%，而ig給藥時為66%。

Tab.1 Pharmacokinetic parameters of MDZ and　its metabolite 1′-OH-MDZ determined by LC-MS/MS following intranasal or ig of MDZ（1 mg·kg-1）in rats

2.3 KTZ預處理組大鼠經鼻腔和灌胃給予MDZ后藥代動力學特征比較

大鼠先ig給予KTZ 30 min后，再分別ig（藥時曲線見圖2）及經鼻腔（藥時曲線見圖3）給予MDZ （1 mg·kg-1）（MDZ及1′-OH-MDZ；相應的藥代動力學參數見表2，計算KTZ對MDZ藥動學參數改變倍數（表3）。

Fig.2 Mean concentration-time profile of MDZ（A）and 1′-OH-MDZ（B）following ig of MDZ（1 mg·kg-1）with or without KTZ（30 mg·kg-1）in rats.±s，n=6.

表2結果顯示，大鼠先經ig給予KTZ （30 mg·kg-1）后，再分別經鼻腔和ig給予MDZ （1 mg·kg-1），原型藥物在體內的暴露量幾乎相當，但經鼻腔吸收入血的速度未受影響，仍明顯快于ig給藥。表3結果顯示，合用KTZ后，2種給藥途徑均增加了MDZ原型藥物的體內暴露量，而代謝產物量均未增加，原型藥物的清除速率都明顯降低（MRT增加了4倍）。表4結果進一步證明，大鼠單獨給予MDZ時，ig給藥后產物與原藥的比例（66%）明顯高于鼻腔給藥（16%）。合用酮康唑后，對ig給予MDZ的代謝酶抑制作用非常明顯（產物與原藥的比例從66%降低到19%），統計學檢驗有顯著性差異。但鼻腔給藥后，雖然產物與原藥的比例從16%降低到7%，但是統計學分析無顯著性差異。

Fig.3 Mean concentration-time profile of MDZ（A）and 1′-OH-MDZ（B）following intranasal of MDZ（1 mg·kg-1）with or without KTZ（30 mg·kg-1）in rats.±s，n=6.

Tab.2 Pharmacokinetic parameters of MDZ and 1′-OH-MDZ determined by LC-MS/MS following intranasal or ig of MDZ（1 mg·kg-1）after coadministration with ketoconazole（KTZ）（30 mg·kg-1）in rats

Tab.3 Ratios of pharmacokinetic parameters of MDZ and 1′-OH-MDZ following intranasal or ig of MDZ（1 mg·kg-1）after coadministration with（30 mg·kg-1）to the parameters of the administration without KTZ in rats

Tab.4 Percentage of AUC（1’-OH-MDZ）/AUC（MDZ）following ig or intranasal of MDZ（1 mg·kg-1）after coadministration with or without KTZ in rats

3 討論

為了研究MDZ經不同途徑給藥后，在大鼠體內的藥代動力學過程，特別是觀察CYP3A代謝酶抑制劑對MDZ體內的影響，需要建立同時檢測大鼠血漿中MDZ及主要代謝產物1′-OH-MDZ的方法。由于MDZ是經典的CYP3A底物，其檢測方法的報道很多。本研究中建立的方法與文獻相比，檢測范圍相當（MDZ 1～1000 μg·L-1，1′-OH-MDZ 1～100 μg·L-1）［7］。經方法學驗證后，開展了本研究。

大鼠分別經鼻腔和ig給予相同劑量的MDZ后，原型藥物和代謝產物1′-OH-MDZ的藥動學特征顯示出一定的差異。經鼻腔給藥后，MDZ約2 min即達峰值，ig給藥的達峰時間約為25 min（與文獻報道的30 min一致），由于在癲癇和驚厥發作救治時，MDZ能否迅速發揮藥效是十分重要的［8］，相比之下，鼻腔給藥途徑更適合于臨床應用。

由于MDZ是CYP3A的特異底物，臨床上很多藥物是CYP3A的抑制劑［9］，臨床觀察發現合用CYP3A的抑制劑可以延長MDZ的鎮靜時間［10］。考慮到MDZ經鼻腔和ig給藥后藥代動力學特征有明顯的差別，合用CYP3A抑制劑后對MDZ藥代動力學的影響是否有差異也值得研究。結果顯示，合用KTZ，兩種給藥途徑給予MDZ后，原型藥物在體內的暴露量都出現了明顯的增加，口服給藥組的增加程度大于經鼻腔給藥，并且在目前的給藥劑量下，2組的總體暴露量相當（614與597 μg·L-1·h-1），提示當肝和腸道CYP3A的功能均被抑制后，2種給藥途徑的生物利用度是相當的。從MDZ和代謝產物1′-OH-MDZ的AUC變化規律可以看出，合用CYP3A抑制劑后，主要抑制了MDZ的代謝轉化，產物的生成量相對于原型藥物均出現了降低（鼻腔給藥的從16%降低到7%，ig給藥的從66%降低到19%）。除此之外，合用CYP3A的抑制劑KTZ后，MDZ經鼻腔給藥組的達峰時間沒有改變，仍約為2 min，而經ig給藥組達峰時間推遲到1 h左右。上述結果提示，合用KTZ等CYP3A抑制劑后，MDZ經鼻腔途徑給藥對藥效發揮的速度沒有改變，但KTZ對其鼻腔給藥的藥效維持時間可能會明顯延長4倍左右；ig途徑給藥會影響藥效發揮速度，KTZ對其ig給藥的藥效維持時間可能也會明顯延長3～4倍。

MDZ雖然是安全窗范圍較大的藥物［11］，代謝產物的活性也明顯低于原型藥物，但是合用CYP3A抑制劑后，代謝轉化的抑制也會在一定程度上影響藥效發揮的時間。本研究結果提示，MDZ經鼻腔給藥吸收迅速，適合于臨床急救。合用CYP3A抑制劑后，鼻腔給藥不改變藥物吸收速度，但抑制其代謝轉化，體內駐留時間明顯延長，暴露量增加。ig給藥合并給予KTZ后，吸收減慢，抑制代謝轉化，體內藥物暴露量明顯增加。由于MDZ的中樞鎮靜作用，合并用藥時均應考慮適當減少給藥劑量或增加給藥時間間隔，確保臨床安全合理用藥。

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（本文編輯：齊春會 沈海南）

Effect of ketoconazole on pharmacokinetics of midazolam and its metabolite through intranasal and intragastric routes in rats

WANG Juan，WANG Xiao-ying，LI Jing-lai，LI Zheng，ZHENG Ai-ping，ZHANG Zhen-qing，ZHUANG Xiao-mei
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of ketoconazole on the pharmacokinetic（PK）behaviors of midazolam and its metabolite through intranasal and intragastric（ig）routes in rats.METHODS Twenty-four rats were evenly divided into 4 groups.Two groups of rats were administrated singly with midazolam（1 mg·kg-1）through intranasal or ig route.The other two groups were concomitant with CYP3A inhibitor，ketoconazole（30 mg·kg-1），midazolam（1 mg·kg-1）through the same two routes. Blood samples were collected from different time points.Plasma concentration of midazolam and 1′-hydroxymidazolam was determined.Major pharmacokinetic parameters were calculated and statistical tests were performed by using t test.RESULTS Tmaxwas about 2 and 25 min for rats administered singly with midazolam via intranasal or ig routes，respectively and AUC was 296 and 179 μg·L-1·h，respectively.When concomitant with ketoconazole，AUC increased to 2.1 and 3.3 folds the original value for intranasal and ig routes，respectively.However，the Tmaxvalue of midazolam via intranasally didn′t change after being coadministrated with ketoconazole，but Tmaxincreased to 1.14 h via ig.CONCLUSlON Compared with administration via ig，intranasal route administrated midazolam displays significant advantages of faster absorption and higher exposure，which are vital for the first aid.Concomitant with CYP3A inhibitor and midazolam via intranasal route，the absorption speed is not affected，but with the metabolism blocked，the systemic exposure is greatly elevated.While via ig，both absorption speed and metabolism are inhibited.The dose should be cut down or the dosing interval increased in clinic practice in this concomitant situation.

midazolam；ketoconazole；pharmacokinetics；drug interactions

The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09301003-001-009）；National Science and Technology Major Project（2013ZX09J13103-01B）；National Science and Technology Major Project（2014ZX09507001003）；and National Science and Technology Major Project（2014ZX09J14103-01A）

ZHUANG Xiao-mei，E-mail：xiaomeizhuang@163.com

R969.2

A

1000-3002（2015）06-0939-06

國家科技重大專項（2012ZX09301003-001-009）；國家科技重大專項（2013ZX09J13103-01B）；國家科技重大專項（2014ZX09507001003）；國家科技重大專項（2014ZX09J14103-01A）

王 娟，學士，助理實驗師，主要從事藥物代謝研究。

莊笑梅，E-mail：xiaomeizhuang@163.com

（2015-02-09接受日期：2015-11-12）