免疫傳感器在大腸桿菌O157：H7檢測中的研究進展

徐金雷等

【摘 要】大腸桿菌O157：H7是一種典型的致病菌，嚴重感染后會引發敗血癥、腎功能衰竭等危及生命的并發癥，對其進行檢測，在食品安全、醫療衛生、環境保護等方面，都具有十分重要的意義。分析和評述了近年來采用免疫傳感手段對大腸桿菌O157：H7檢測的報道研究，技術主要分為阻抗式、壓電式、表面等離子體共振式、酶標式、熒光標記式、電導式、電致發光式，最后對其研究走向和應用前景進行了展望。

【關鍵詞】大腸桿菌O157：H7；免疫傳感器；檢測；綜述

【Abstract】Escherichia coli O157：H7 is a kind of typical pathogenic bacteria. Life-threatening complications including hematosepsis， renal failure will be leaded after severe infection. The detection of Escherichia coli O157：H7 have a very important significance in the food safety， medical and health， environmental protection and other aspects. This paper analyzed and reviewed recent reported research for detection of Escherichia coli O157： H7 by immune-sensing means. Immune-technologies mainly divided into impedance type， piezoelectric transducer type， surface plasmon resonance type， enzyme label type， fluorescent marker type， conductometric type， electrochemiluminescence type. Finally， the research study direction and application prospect are looked into the distance.

【Key words】Escherichia coli O157：H7； Immune sensor； Detection； Review

0 引言

大腸桿菌O157：H7對人的致病力較強，每克感染載體含菌10個以上即可能引起感染。嚴重感染大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7，E. coli O157：H7）后，會產生大量的Vero毒素，從而引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜等。因此，對E. coli O157：H7的預防和檢測，具有重要的意義。

常規實驗室對E. coli O157：H7的鑒定、檢測依然停留在分離培養、形態觀察、生化鑒定和血清學分型水平，這些傳統的方法操作復雜、檢測周期較長。免疫傳感器是由固定化的生物敏感材料作為識別元件與適當的理化換能器及信號放大裝置構成的分析系統。具有特異、靈敏、高效、經濟實用等優點，可以在物質分子層面進行快速、微量檢測，目前正成為一種強有力的通用分析工具。該文就免疫傳感技術在檢測E. coli O157：H7方面的最新進展進行簡要綜述，并展望該技術在致病菌檢測方面存在的難點與研究前景，期望對該領域的研究提供一定的參考價值。

1 檢測大腸桿菌O157：H7的免疫傳感器

1.1 阻抗式

阻抗式免疫傳感器是通過檢測修飾電極的界面特性來分析樣品中E. coli O157：H7的一種方法。Barreiros等以ITO為基底，構建特意識別E. coli O157：H7的傳感界面，實現了E. coli O157：H7的特異、靈敏檢測。檢測線性范圍為10～106 CPU/mL，檢測限達1 CPU/mL[1]。Wang等使用絲網印刷電極制備了可拋式、簡易的E. coli O157：H7阻抗傳感器，檢測限為1.5×103 CFU/mL，線性范圍為1.5×103～1.5×107 CFU/mL[2]。該類方法不需要標記、且傳感器制備較簡化，而得到廣泛研究，但該方法與傳統方法相比較其靈敏度偏低，實際樣品分析系統有待進一步完善。

1.2 壓電式

壓電免疫傳感器依靠測量質量的變化來實現目標物的測定，即在生物化學反應過程中，壓電石英晶體表面被修飾、選擇性地與被檢測物質作用，繼而在晶體表面出現異號極化電荷（又稱壓電效應），從而實現生物傳感器的檢測目的。Farka等有機結合石英晶體微天平的有效、被動技術，實現了E. coli的檢測，檢測限位8×104 CFU/mL[3]。Shen等研發了E. coli O157：H7的一種新型壓電檢測方法，使用了免疫磁珠技術，檢測時間為4小時，在磷酸鹽緩沖溶液中的檢測限為23 CFU/mL，在牛奶中的檢測限為53 CFU/mL[4]。壓電生物傳感器的特點是樣品無需標記、響應靈敏、特異性高、簡便快速、易于自動化與集成化。

1.3 表面等離子體共振式

當生物分子結合到金屬表面時，會引起表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）折射率及入射角的改變，因此通過監測生物反應過程中SPR角的動態變化，可以得到生物分子之間相互作用的特異性信號，以此來研究生物分子間的相互作用。Tokel等對SPR進行了評述，并用于E. coli的檢測，檢測線性范圍1.0×105到3.2×107 CFU/mL[5]。Usachev等研制的SPR免疫傳感器，對溶液中E. coli的檢測限為15×103 CFU/mL，對應空氣中的含量為219×104 CFU/mL[6]。SPR免疫傳感器的研究在生物傳感器領域的應用已相對成熟，部分成品儀器已應用到E. coli O157：H7的檢測。SPR 技術具有非破壞性、無需標記、實時監測、靈敏度及選擇性高的優點；但SPR傳感技術對于低濃度、小分子量的分子檢測精度不高。

1.4 酶標式

Shen等采用免疫磁珠和細小金納米粒子構建了增強型酶聯免疫檢測體系，根據顏色變化，在磷酸鹽緩沖溶液中，對E. coli O157：H7的檢出限為68 CFU/mL，對食品中E. coli O157：H7的檢測線性為6.8×102到6.8×103 CFU/mL，是普通免疫磁珠分離基酶聯免疫檢出限的兩倍，比普通酶聯免疫檢測靈敏度提高了四倍，整個分析過程在3小時內完成，為一種高效、靈敏的檢測方法[7]。Zhag等借助葡萄糖氧化酶、漆酶的雙重放大功能，研制了一種靈敏的檢測E. coli O157：H7的化學發光免疫傳感體系，借助產生的過氧化氫，構建魯米諾的發光，從而實現對E. coli O157：H7的檢測，檢測時間小于2小時，線性區間為4.3×103 CFU/mL到4.3×105 CFU/mL，檢出限為1.2×103 CFU/mL，具有一定的推廣價值[8]。至今，酶標法傳感器主要通過兩種方式實現，一是酶直接與底物作用產生光學信號，二是借助酶產生的電信號。多數情況下，可以通過直接改變標記底物獲得可檢測的信號（熒光、化學發光，電信號）。但是，標記酶的穩定性和活性保持能力有待發展，發展人工模擬酶在該領域的應用，也是很好的發展方向之一。

1.5 熒光標記式

近年來， 基于熒光標記方法構建的生物傳感器廣泛應到致病菌的檢測中。Chen等以包裹熒光素的硅球為標記，借助熒光顯微鏡、流式細胞儀構建了E. coli O157：H7的快速間接檢測系統，熒光顯微鏡可以檢測到1.0×105 cell/mL 的E. coli O157：H7；流式細胞儀可以檢測到混合液中4.5×106 cell/mL 的E. coli O157：H7，并成功應于啤酒中E. coli O157：H7的檢測[9]。Cho等借助免疫磁珠技術，實現了E. coli O157：H7、傷寒沙門氏菌、單核細胞增多性李司忒氏菌三種致病菌的原位熒光分別檢測，對食物樣品中致病菌的檢出限都約為5 CFU/mL[10]。熒光標記由于快捷、便利、簡單等優勢，在E. coli O157：H7的檢測應用中，具有較好的發展前景。

1.6 電導式

Sarra等研究了一種基于電導信號的免疫傳感器，并成功用于E. coli和粘質沙雷氏菌的檢測，檢測區別為1到103 CFU/mL[11]。Hnaiein等構件了一種基于免疫磁性粒子的電導式E. coli檢測體系，該方法對E. coli具有較好的特異性，1 CFU/mL E. coli的變化可以產生35 mus電導檢測信號，檢測可達500 CFU/mL[12]。電導式免疫傳感器尚處于發展階段，存在較大的發展空間。

1.7 電致發光式

Leach等采用自動化的電致發光系統實現樣品中E. coli O157：H7的檢測，經5 h的富集之后，檢測靈敏度可以達到0.1 CFU/g，整個實驗可以在6.5 小時內完成[13]。目前，電致化學發光的標記物有限，且其穩定性有待進一步改善。

2 結論與展望

抗原-抗體特異識別E. coli O157：H7所建立的傳感器，統稱為E. coli O157：H7免疫傳感器。其兩大主要部分就是識別元件和信號傳遞元件，根據信號源不同，主要分為免標記直接檢測型和帶標記間接檢測型兩類。前者簡單、花費低，但靈敏度較低，限制了其應用；而后者應用相對較廣泛。與其它方法相比，免疫傳感器檢測E. coli O157：H7還處于起步階段，但是E. coli O157：H7免疫傳感器具備快速、靈敏、便攜、易操作的發展前景，決定了其在E. coli O157：H7檢測將占有一席之地。

生物傳感器作為一種發展中的檢測手段，各種分類之間有其相互交叉的地方，因此可以通過不同方法與傳感器結合開展研究，將多種方法相互融合、取長補短實現檢測的最終目標：高通量、高靈敏、快速便攜、易操作。隨著分子生物學技術的迅速發展，使得快速、準確檢測E. coli O157：H7成為可能，并為該領域的研究開拓更廣闊的前景。

【參考文獻】

[1]Dos Santos M.B.； Azevedo， S.； Agusil， J.P.； et al. Label-free ITO-based immunosensor for the detection of very low concentrations of pathogenic bacteria[J]. Biolectrochemistry， 2015，101：146-152.

[2]Wang Y.X.； Ye Z.Z.； Ying Y.B. Development of a disposable impedance biosensor and its application for determination of Escherichia coli O157：H7[J]. Transactions of the Asabe， 2014，57（2）：585-592.

[3]Farka Z.； Kovar D.； Skladal P. Rapid Detection of Microorganisms Based on Active and Passive Modes of QCM[J]. Sensors， 2015，15（1）：79-92.

[4]Shen Z.Q.； Wang J.F.； Qiu Z.G.； et al. QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157：H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold[J]. Biosensor & bioelectronics， 2011，26（7）：3376-3381.

[5]Tokel O.； Yildiz U.H.； Inci F.； et al. Portable Microfluidic Integrated Plasmonic Platform for Pathogen Detection[J]. Scientific reports， 2015，5.

[6]Usachev E.V.； Usacheva O.V.； Agranovski I.E. Surface plasmon resonance-based bacterial aerosol detection[J]. Journal of applied microbiology， 2014，117（6）： 1655-1662.

[7]Shen Z.Q.； Hou N.A.； Jin M.； et al. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli O157：H7 using immunomagnetic and beacon gold nanoparticles[J]. Gut pathogens， 2014， 6， DOI：10.1186/1757-4749-6-14.

[8]Zhag Y.； Tan C.； Fei R.H.； et al. Sensitive Chemiluminescence Immunoassay for E. coli O157：H7 Detection with Signal Dual-Amplification Using Glucose Oxidase and Laccase[J]. Analytical chemistry， 2014，86（2）：1115-1122.

[9]Chen Z.Z.； Cai L.； Chen M.Y.； et al. Indirect immuno uorescence detection of E. coli O157：H7 with uorescent silica nanoparticles[J]. Biosensors and bioelectronics， 2015，66：95-102.

[10]Cho I.H.； Mauer L.； Irudayaraj J. In-situ uorescent immunomagnetic multiplex detection of foodborne pathogens in very low numbers[J]. Biosensors and bioelectronics， 2014，57：143-148.

[11]El Ichi S.； Leon F.； Vossier L.； et al. Microconductometric immunosensor for label-free and sensitive detection of Gram-negative bacteria[J]. Biosensors and bioelectronics， 2014，54：378-384.

[12]Hnaiein M.； Hassen W.M.； Abdelghani A.； et al. A conductometric immunosensor based on functionalized magnetite nanoparticles for E. coli detection[J].Electrochemistry communication， 2008，10（8）：1152-1154.

[13]Magana S.； Schlemmer S.M.； Leskinen S.D.； et al. Automated dead-end ultrafiltration for concentration and recovery of total coliform bacteria and laboratory-spiked Escherichia coli O157：H7 from 50-liter produce washes to enhance detection by an electrochemiluminescence immunoassay[J]. Journal of food protection， 2013，76（7）：1152-1160.

[責任編輯：鄧麗麗]