肉制食品中動物源性成分鑒別方法研究新進展

劉夢恬

【摘 要】食品安全問題是涉及民生的重大問題。當前，肉制品摻假造假現象較為普遍，嚴重擾亂市場秩序，危害人們健康。在肉類摻假形式層出不窮的情勢下，對動物源性成分鑒別的方法研究逐步成為食品安全領域的研究熱點。由于食品中的肉類經過切碎、混合、蒸煮、熏烤等加工烹調過程后，失去了原有的形態學特征和質地，增加了品種鑒定的困難。

【關鍵詞】肉制食品；摻假；動物源性成分；鑒別方法

0 序言

民以食為天，食以安為先，食品是人類社會賴以生存的第一物質基礎，而食品中肉制食品的消費比例一直在食品消費行業中占據十分重要的地位。因為肉制食品是人體蛋白質和微量元素的重要來源。但近年來全球的肉制食品安全狀況實在令人擔憂。20世紀以來瘋牛病，禽流感、馬肉風波、摻假肉、過分添加各種添加劑的事件層出不窮，暴露了嚴重的食品安全問題嚴重的威脅到了人類的生命安全。由于不同的肉制品其品質和價格均有差異，當前很多不法商販以低價肉類代替高價肉類出售，不僅嚴重損害了消費者的利益，而且也從另一方面透露出食品安全的風險。為了更好的保障食品安全，目前已經研究出的肉制品摻假技術有16種左右，從先進程度依次有：以顯微鏡為基礎的物理方法，以檢測蛋白質為基礎的免疫學方法，以檢測DNA的分子生物學方法，以高效液相色譜技術的化學方法以及應用近紅外反射光譜學的方法等。而目前最為常用的是高效液相色譜技術研究肉類摻假。

1 肉制品中常見的摻假形式

對于近年來造成肉制品摻假的主要原因是商家為了謀取暴利而將廉價肉類摻入到價值較高的肉類當中。這是消費者當前最為擔心和關注的一種肉制食品摻假形式。而實際上，對于肉制品的摻假形式并不只是單一的摻入廉價肉類，而是在其生產、加工過程中的任何一個環節都有可能出現摻假行為。根據有關報道將肉制品的摻假和欺詐的問題歸納為4類，分別為肉的來源、肉成分被替代、肉類在加工過程的改變以及非肉類成分的添加。而在我國市場存在的肉類摻假問題主要集中在將低價肉摻入到牛羊等高價肉種中。根據摻假方式造成惡劣程度可以分為三種情況。行為最為惡劣的是使用來源不明的非可食用肉類進行摻假，多見于流動攤販。常見的摻假肉類有鼠肉、貓肉、狗肉等。其次是用來源可追溯的非可食用肉類進行摻假。主要涉及的肉類有馬肉、狐貍肉以及貂肉等。而惡劣行為最為輕微的是用低價值的可食用肉類（如雞肉、鴨肉、豬肉）摻入牛、羊肉中。火鍋使用的羊肉卷是羊肉摻假形式最為嚴重的情況，消費者沒有一定的經驗和專業知識是很難將其從宏觀上鑒別的。對于這一系列的摻假行為則需要相應的檢測技術將其一一鑒別。

2 動物源性成分鑒別方法

由于肉制品的摻假形式多種多樣就決定了檢測技術的多樣性，才能保證每種摻假行為都有相應的檢測技術對其真偽進行鑒別。常見的肉制品真偽鑒別方法包括：物理方法主要運用顯微鏡進行觀察，基于蛋白質的檢測方法如常用的免疫學方法，基于DNA的分子生物學的分析技術如PCR，實時定量PCR和基因芯片技術等，還有應用較有針對性的近紅外反射光譜學的方法。

2.1 基于顯微鏡觀察的物理方法

以顯微鏡為基礎的物理方法，是唯一一個被歐盟認可的檢測肉制食品動物源性成分的官方方法，這項方法主要是檢測動物的骨頭組織，q區分陸地動物的肉制品和魚制品。骨頭是最常見的成分，在肉制品內也可能含有被粉碎的骨頭，即使經過長時間高溫煮熟也能被檢測出來。利用此方法進行檢測的關鍵是觀察片狀骨頭薄片之間的空隙，不同種類的動物有不同的空隙形狀，通過觀察空隙的形狀從而判斷組織為何種動物。在低倍鏡下主要觀察沉淀物的一般結構和顏色是辨別不同肉類的第一步。動物的肌肉纖維一般沒有各自特點，判定動物源性成分的重要依據是是否有動物肌肉纖維的出現。對于此方法，有經驗的人告訴我們只有在理想的狀態下才能夠區分禽類和魚類制品。雖然此方法對于檢測肉類摻假的運用會便捷，簡單且成本低，但由于理想狀態的條件在現實生活中很難達到，也就成為此方法不能被廣泛應用的原因了。

2.2 基于蛋白質檢測的免疫分析法

隨著抗體技術的不斷發展，肉類摻假使用的免疫檢測技術大量出現。主要包括試管沉淀法，瓊脂擴散法，放射免疫法，免疫組化，對流免疫對流法和酶聯免疫分析法（又稱ELISA技術）。其中應用最為廣泛的是酶聯免疫分析法。因為傳統的免疫分析法以抗原與抗體特異性結合為基礎，只能鑒別粗加工肉類，對于經過加工處理的肉制品而言，蛋白質發生了變性而使原來的抗原特性發生了改變，此時只有熱穩定性的蛋白質標記物肌鈣蛋白I才能例如用于檢測。在研究次方法的學者中也取得了一定優秀的成果，例如：Macedo-Silva等通過制備抗牛、雞、豬、馬白蛋白的抗血清建立了ELISA方法用于鑒別單一樣品和混合樣品的成分，靈敏度可達0.6%。Chen等發展了以單克隆抗體建立的ELISA方法檢測豬肉中的熱穩定性肌肉蛋白，并且用該方法對原料和經過加工過的肉類和飼料中豬肉的含量進行定量分析。在不同來源的肉類混合物中豬肉的檢測限為0.5%～0.05%。雖說此方法已經得到了在某些肉制品摻假中起到了一定的作用，但是卻仍有以下一些方面的不足：一是抗原—抗體的特異性結合免疫分析法在親緣關系較近的物種中容易出現交叉反應，且在加工肉制品中抗原的溶解特性和抗原表位都會相應發生變化；二是單克隆抗體雖然能大大的提高檢測的特異性，但制備它的成本高且耗時長，在一些緊急條件需要檢測的條件下十分的不適用。

2.3 基于DNA的分子生物學方法（DNA分析法）

科技不斷發展，基于DNA分子生物學檢測肉制品真實性鑒別方法的研究也越來越多。較早的研究主要運用DNA雜交的方法，而目前則集中于以PCR為基礎的各類分析方法，其中包括DNA測序、物種特異性PCR、實時定量PCR等。DNA分析法的應用原理為通過分析物種的基因組DNA或線粒體DNA序列差異進行鑒定。線粒體DNA相對于基因組DNA有更加獨特的優勢。主要由于線粒體DNA進化速度快和穩定性強的特性，每一個線粒體中有多個拷貝的線粒體DNA分子，適合用于擴增遺傳變異，結構簡單，分子量小，為16.5kb大多數為編碼基因易于測序，線粒體DNA呈嚴格的母系遺傳，在世代遺傳過程中不發生重組，一個個體即代表一個母系集團，且線粒體的進化速度比核DNA快。線粒體基因組在不同的區域有不同的進化速度，因此可以選擇合適區域進行研究。其中線粒體DNA的熱穩定性和高效的拷貝數有助于DNA片段的保存確保有足夠的模板進行PCR擴增。

2.3.1 DNA分子雜交技術

DNA雜交技術是較為傳統的DNA分析技術，它主要是通過堿基互補配對利用放射性同位素和標記元素等信號分子的特有的DNA片段識別與其互補得序列DNA。其外在表現形式為根據信號分子的強弱判斷樣品成分有哪些類別以及數量的多少。有學者已經運用此技術鑒別了加工肉制食品中的羊肉，兔肉，牛肉，豬肉等的源性成分，實現了半定量的測量。但是該方法檢測效率低，操作繁瑣，因此逐漸被興起的PCR技術取代了。

2.3.2 基于PCR的核酸擴增技術的方法

PCR技術是在DNA聚合酶的催化下，以DNA母鏈為模板，特定引物為起點，在體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈的這一反復拷貝的過程。起到關鍵作用的是引物個探針的使用，從而決定了其適應程度的好壞。

常用的物種特異性PCR方法與其他PCR比較具有靈敏度高，簡單，快速的優點。根據肉制品的組成成分為混合的這一特點，此方法運用起來十分方便，而在同一PCR反應過程中簡單的物種數量有限的，則可以運用基因組DNA和線粒體DNA進行相應的物種鑒別。也有大量的研究人員在此技術上獲得了成就主要有：Herman通過設計cytb基因的物種特異性引物成功地鑒別了食品中雞肉、火雞肉、豬肉、牛肉和羊肉成分。Piknova等利用cytb基因鑒別了牛源性成分。Kesman等通過設計線粒體DNA引物特異性檢測加工肉腸中的豬肉、馬肉和驢肉成分。對于此方法是否能用于商品化肉制品的摻假鑒別，只需關注兩個物種混合樣品中每個物種的檢出限是否都能達到0.1%，若都達到，則表明這種方法可用于肉制品的摻假鑒別。

單一物種的PCR擴增方法是不能滿足當代復雜多樣的摻假肉制食品鑒定，因而又研究出了在同一PCR反應體系中采用多個引物對多個肉類物種進行同步，精確和快速檢測。這便是多重PCR分析法該方法成本低、省時、高效，可對多種成分同時鑒別。

為提高鑒定的準確度、靈敏度、以及操作的簡易化，將DNA雜交技術與PCR技術相結合用于肉制食品摻假技術的鑒別也成為研究熱點。因此該方法操作簡便，快速，篩選量大。還有最新研究的基因芯片技術，在肉制食品的摻假鑒別中，除了以上優點外還有對于未知樣品的分析和確認可以提供大量的信息。其工作原理是是應用已知核酸序列與互補的靶序列雜交，從而根據雜交信號對待檢測樣品進行定性和定量分析。有德國公司研發的一種特殊的LED芯片分析試劑盒針對馬、牛、羊、豬、雞、鴨等十四種動物的線粒體16S rRNA特異性位點進行設計，檢測和分析。該方法可檢測低于0.5%的動物成分，從數據中可反應其靈敏度高。

2.4 近紅外反射光譜學（NIRS）檢測法

NIRS是利用樣品的光學特性，利用反射，能見度或纖維光學特性區分不同種肌肉的種類，是一種快速，有效檢測不同物種肉類成分的方法。在近紅外光譜范圍內，利用近紅外光譜學不僅能夠分析分子的化學結構，而且能夠構建樣品特征光譜。由于近紅外光譜對被檢測物質無損害，且具有快速，靈敏度高，成本低等優點，已經有國外學者利用此方法分析一些碎肉的反射光譜。同時對馬肉、牛肉、羊肉、駝肉等進行了鑒別，取得了良好的成效。

3 討論與展望

肉類摻假問題是一個長期存在的問題，雖然已經研究了許多相關技術進行解決但是它仍然是一個全球性的關注熱點。而對于當今的科技時代，肉類摻假形式的多樣化和復雜化，導致僅僅依靠傳統的的感官與經驗形態的方法鑒別手段，已遠不能滿足肉及肉制品摻假問題控制與監管的需要。科技的日新月異，將生物學、光譜學、儀器分析、化學計量學等各大學科相結合，不斷發掘和研究出新的檢測技術并得到了長遠的發展。但是，絕大多數的檢測技術所需要的大型儀器都是進口的，所花費的成本較高，而這類儀器也只有在較大規模的實驗室中才有。對此，如果要提高實驗室的工作效率，同時又要建立和完善從高級實驗室到現場進行快速檢測的實驗體系，就需要不斷的開發成本低，操作簡便，同時靈敏度和準確度較高能用于現場快速檢測的方法和檢測的器材將更有助于肉制品市場的監督從而保障消費者的權益，這樣的研究和開發都具有十分重要的現實意義。

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