UPLC—MS/MS法在藥物成分分析領域的應用研究進展

王沛　李建定

【摘 要】超高效液相色譜串聯質譜法（Ultra - high performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）結合了超高效液相色譜強大的分離能力和質譜在定性、定量分析方面的高靈敏度及專屬性強優勢，較好地適應了現代藥物研究對自動化、高通量分析方法的需求，已成為藥物分析的重要方法之一。綜述了UPLC-MS/MS 法在藥物成分分析領域的應用研究進展。

【關鍵詞】UPLC-MS/MS；藥物成分分析

液質聯用技術由液相色譜、質譜及接口技術三部分組成，相對于通常的檢測方式，能提供更優越的選擇性和更低的檢測限，已成為現代實驗室一種快速、準確的分析工具。超高效液相色譜（UPLC）是美國Waters公司于2004年3月正式推出的分離科學新技術。它是基于小顆粒填料和LC原理的一種創新方法，實現了超高分離度、靈敏度和分析速度。質譜（MS）是離子，如分子離子，碎片離子等按質荷比（m/z）大小而依次排列的譜圖，通過對樣品氣相離子質荷比大小和豐度的測定進行化合物的組分分析和結構分析，是化合物的“化學指紋圖譜”之一。

UPLC是質譜檢測器的最佳液相色譜入口，除UPLC本身帶來的速度、靈敏度和分離度的改善外，UPLC的超強分離能力有助于目標化合物與之競爭電離的雜質的分離，從而可以使質譜檢測器的靈敏度因離子抑制現象的減弱或克服而得到進一步的提高。UPLC與MS聯用，可以充分發揮兩者的優勢，與傳統的高效液相色譜和質譜聯用（HPLC-MS）相比，顯著提高了定量分析的重復性和可靠性以及定性分析的準確性，較好地適應了現代藥物研究對自動化、高通量分析方法的需求，已成為藥物分析的重要方法之一[1-4]。本文綜述了UPLC-MS/MS法在藥物成分分析領域的應用研究進展。

1 藥物成分的快速化學表征

王邱等以超高效液相為分離手段，飛行時間質譜儀為鑒定方法，水飽和正丁醇為提取溶劑，以0.05%甲酸水（A）-0.05%甲酸乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫，采用ESI負離子模式進行數據采集。根據實驗結果，并結合相關參考文獻，二級質譜裂解數據以及元素組成，分離、鑒定出17種皂苷類成分，并發現三七中含有姜糖酯B成分。實驗結果表明經過超高效液相的分離，及質譜二級負離子信息的鑒定，為分析三七中皂苷類成分提供了一種快速、簡便、可靠的方法，能夠為三七藥材在真偽鑒別、質量評價、藥代動力學等方面的研究提供方法基礎[5]。

王金鳳等建立超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，分離表征葛花中異黃酮成分。利用LTQ超高效液相色譜-質譜系統（美國，Therm公司），研究經乙酸乙酯純化的葛花乙醇提取物，分離出7種異黃酮成分，經鑒定為大豆苷、大豆苷元、鳶尾苷、鳶尾苷元、染料木黃酮、印度黃檀苷和雞豆黃素。樣品中異黃酮成分分離度較好，基線平穩，分離效果理想，快速、準確、靈敏度高，可以作為葛花異黃酮鑒定的有效方法[6]。

池玉梅等以黃酮對照品為研究前體，藥用植物小毛茛為研究對象，采用超高效液相色譜/二極管陣列檢測器-電噴霧四極桿串聯飛行時間質譜（UPLC/DAD-ESI/Q-TOF MS）分析了黃酮類化合物同系物及同分異構體的色譜、質譜特性。結果顯示：黃酮氧苷和黃酮碳苷的紫外吸收光譜及二級質譜具有顯著性差異，糖苷化位置同保留時間、二級質譜碎片及相對豐度具有相關性。將該方法應用于小毛茛莖葉醇提液的分析，結合其酸水解液的分析，解析了22個黃酮醇糖苷和3個苷元[7]。

2 藥物成分含量測定

羅玲等建立了檢測注射用雙黃連粉針劑中7種活性成分（綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷）含量的UPLC-MS/MS方法。采用Agilent Zorbax C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm），流動相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，體積流量0.40mL·min-1，柱溫30℃；質譜條件為電噴霧離子（ESI）源，負離子模式檢測，多重反應監測（MRM）掃描。7個活性成分在考察的線性范圍內，進樣濃度與峰面積之間線性關系良好（r>0.9983），精密度RSD<4.2%；重復性RSD<6.3%，平均加樣回收率在92.2%～102.7%。該方法準確、快速、重復性好，可作為雙黃連粉針劑的質量控制參考方法[8]。

顧瑤華等以Agilent Z0RBAx Eclipse XDB-C18為色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）為流動相，使用超高速液相色譜儀（Agilent 1200 UPLC，德國）和三重四級桿質譜儀（Agilent QQQ-MS/MS 6410A，美國，），建立同時測定五味消炎靈含片中丹參酚酸、黃芩苷、葛根素、綠原酸、咖啡酸含量的UPLC-MS/MS方法。結果所檢測的各色譜峰分離度良好，方法學實驗結果符合要求；該方法可以為五味消炎靈含片的質量控制提供依據[9]。

范曉蘇等建立了同時測定復方杏香兔耳風膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術內酯III和白術內酯I等10種有效成分含量的UPLC-MS/MS雙內標分析方法。以咖啡酸和淫羊藿苷為內標（IS），在ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 色譜柱上，以甲醇和含0.3%甲酸的水為流動相進行梯度洗脫分離，流速為0.3moL/min。在電噴霧電離（ESI）正、負離子切換模式下，采用多重反應監測模式進行檢測。結果表明，原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術內酯III和白術內酯I的線性范圍分別為0.00300～24.0mg/L、0.0170～2.00mg/L、0.0150～30.0mg/L、0.00400～30.0mg/L、0.0105～24.0mg/L、0.00300～30.0mg/L、0.00300～5.00mg/L、0.00600～5.00mg/L、0.00150～4.00mg/L、0.00600～0.900mg/L；檢出限分別為1.0、11、5.0、1.5、3.5、1.0、1.0、2.0、0.5、0.2μg/L。10種成分的加樣回收率為92.5%～106%，相對標準偏差均不大于3.2%。該方法快速簡便、靈敏度高、重復性好，已成功用于實際樣品的分析[10]。

3 中藥制劑中非法加入化學藥物成分檢測

黃衛平等使用Acuity UPLC超高效液相色譜系統（Waters公司）和Synapt G2四極桿/飛行時間串聯質譜儀（Water公司），通過比較樣品峰與對照品峰的保留時間、一級質譜和二級質譜碎片離子，建立了測定抗風濕類中藥制劑中非法添加醋酸潑尼松、萘普生、醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和布洛芬的UPLC-MS/MS分析方法。實驗結果表明，采用UPLC-MS/MS技術，將高效液相色譜的高分離能力與質譜分析的高選擇性相結合，抗風濕類中藥制劑樣品經一次提取即可快速、準確地對非法摻入醋酸潑尼松、萘普生、醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和布洛芬進行多級質譜分析，并進行了結構確證，靈敏度高，選擇性強，增強了檢測結果的可信度，對該類中藥制劑的質量控制具有現實意義[11]。

【參考文獻】

[1]黃昆，王文輝，等.超高效液相色譜和質譜聯用在藥物研究領域的應[J].光譜實驗室，2009，26（4）：922-930.

[2]王勇躍，梁健謀，等.UPLC梯度洗脫法測定注射用阿洛西林鈉中有關物質[J].中國抗生素雜志，2015，40（3）：192-196.

[3]Ying Ding， Kai Huang， et al. Simultaneous quantitative analysis of dextromethorphan， dextrorphan and chlorphenamine in human plasma by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A， 2011，1218（41）：7371-7376.

[4]LU Chun-mei1， WANG Ming-tai et al. Determination of Sex Hormones in Antler Velvet by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry [J]. CHEM. RES. CHINESE UNIVERSITIES， 2012，28（2）：191-194.

[5]王邱，馮毅凡，等.UPLC /Q-TOF MS 對三七中皂苷類成分的快速化學表征[J].天然產物研究與開發，2014，26：1233-1239.

[6]王金鳳，魏穎，等.超高效液相色譜串聯質譜法檢測葛花中異黃酮[J].中成藥，2014，36（10）：2125-2127.

[7]池玉梅，李瑤，等.超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜分析黃酮類化合物及小毛茛莖葉的成分[J].色譜，2013，31（9）：838-844.

[8]羅玲，黃玉嬋，等.UPLC-MS-MS同時測定雙黃連粉針中7種活性成分[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（13）：80-84.

[9]顧瑤華，巢為農.UPLC-MS/MS測定五昧消炎靈含片中5種成分的含量[J].南京中醫藥大學學，2014，30（6）：578-580.

[10]范曉蘇，龐倩，等.超高效液相色譜-串聯質譜雙內標法同時測定復方杏香兔耳風膠囊中的10種有效成分[J].色譜，2014，32（3）：216-223.

[11]黃衛平，李琴，等.超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜測定抗風濕類中藥非法添加的化學藥物成分[J].中華中醫藥學刊，2014，32（11）：2707-2714.

[責任編輯：湯靜]