酒糟生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物的固態(tài)發(fā)酵工藝研究

馮會家　王建興　趙瓊洲

【摘 要】提出了利用酒糟制備酵母培養(yǎng)物，既可以作為飼料蛋白，又可以作為動物益生因子。確定了最佳發(fā)酵工藝條件。

【關(guān)鍵詞】酒糟；酵母培養(yǎng)物；固態(tài)發(fā)酵工藝

0 研究背景

酒糟含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖、纖維素、維生素及香味物質(zhì)等。目前，其用途主要為直接作為飼料、制作調(diào)味品及培養(yǎng)食用菌等，其附加值低。如何使堆積如山的酒糟變廢為寶，亟待解決。

酵母培養(yǎng)物，是一種新型綠色微生態(tài)制劑，指酵母菌在特定條件下發(fā)酵基質(zhì)而制得的產(chǎn)品，主要由基質(zhì)，酵母細(xì)胞及代謝產(chǎn)物組成。這些物質(zhì)能促進(jìn)動物腸胃微生物的生長，改善消化能力，提高免疫力、脫毒，因此有利于動物的健康生長，在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用前景廣闊。飼料行業(yè)需要大量的蛋白原料，我國每年進(jìn)口3000萬噸以上的大豆才能滿足需要。黃酒糟富含蛋白質(zhì)，但其營養(yǎng)價(jià)值不均衡、含水量高、直接飼喂利用率低，且常常堆積變質(zhì)。利用酵母發(fā)酵黃酒糟，可作為一種很好的蛋白飼料來源，在一定程度上緩解蛋白飼料的壓力。

1 過程與方法

1.1 材料，試劑及器材

材料：黃酒糟、釀酒酵母和糖化酶等。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，胰蛋白胨2%，酵母浸粉1%，瓊脂粉1.8%，滅菌115℃、20min。使用前以入100μg/mL添加氨芐青霉素，終濃度為100μg/mL。

儀器：恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、恒溫?fù)u床、顯微鏡、干燥箱等。

1.2 種子液制備

稱取適量干酵母于100mL的三角瓶，以1：9（g：mL）加入以溫度為38～42℃的蒸餾水，1%添加葡萄糖，封口，于38～42℃水浴15min，28～32℃水浴活化1h至起泡，即為活化好的酵母種子液。

1.3 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

新鮮黃酒糟于烘箱中45℃烘干，密封保存。用時(shí)取適量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加一定比例的物質(zhì)拌勻，每組設(shè)置3個(gè)平行，分別計(jì)數(shù)，求平均值。優(yōu)化過程如下：

首先，對糖化酶添加量進(jìn)行優(yōu)化，起始發(fā)酵條件為：取20g干糟，加入罐頭瓶中，水料比1：1，接種量1×108CFU/g，糖化酶添加量分別為0、50、100和250U/g，自然pH，封口。培養(yǎng)30℃、72h，計(jì)算活菌數(shù)。其次，對裝料量進(jìn)行優(yōu)化，在前一批優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇最優(yōu)的糖化酶添加量100U/g，裝料量梯度分別為10，20，30，40和50g，其它條件不變。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。依次類推，分別對水料比（0.50，0.75， 1.00，1.25和1.50），接種量（0.50×108，1.00×108，1.25×108，1.50×108和2.00×108CFU/g），溫度（25、28、30、32和35℃）和pH值（4.0，4.5，5.0，6.0和7.0）進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 酵母活菌計(jì)數(shù)

發(fā)酵結(jié)束后，將產(chǎn)物取出，平攤于報(bào)紙上，將粘結(jié)的發(fā)酵物切成大小基本一致的顆粒狀，置于45℃鼓風(fēng)干燥箱，每隔1h進(jìn)行翻動1次，烘干。取10g于250mL的三角瓶中，加入90mL蒸餾水，適量滅菌的玻璃珠，封口，30℃、200r/min振蕩30min。將三角瓶取出，靜置20s，即為10-1稀釋液。取該稀釋液1mL，加入到9mL無菌水的試管中，搖勻成10-2稀釋液，依次稀釋至10-5-10-7，各取100μL涂布于YPD平板，培養(yǎng)箱中30℃倒置培養(yǎng)2d后計(jì)數(shù)。

1.5 酵母自溶（酵母培養(yǎng)物的制備）

發(fā)酵結(jié)束之后，往罐頭瓶中加入45mL水、180mg蛋白酶（50U/mg）和12mg的酵母破壁酶（400U/mg），調(diào)節(jié)pH值為6.5，于50℃作用24h，45℃烘干。此時(shí)90%以上酵母細(xì)胞壁破裂，釋放營養(yǎng)物質(zhì)。

1.6 成分分析

為了對比黃酒糟及酵母培養(yǎng)物的營養(yǎng)成分，分別測定粗蛋白、多肽、粗脂肪、還原糖、粗淀粉、粗纖維和灰分的含量。為評價(jià)可溶性蛋白的分子量分布，取1g干酒糟或酵母培養(yǎng)物溶解于10mL醋酸緩沖液中（0.05M，pH4.5），搖勻，沉淀10m，4℃、10， 000r/min離心10min，去掉沉淀，將上清通過0.2μm濾膜，用快速蛋白液相色譜儀（SuperdexTM 75色譜柱）檢測多肽及氨基酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

酒糟中含有大量酵母無法利用的淀粉，糖化酶可以將淀粉降解成小分子的糖類。結(jié)果表明（圖1），添加糖化酶效果顯著，添加量為100U/g時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到穩(wěn)定值為對照組的2.6倍，后略有降低，糖化酶價(jià)格較為昂貴，以100U/g為最適添加量。

酒糟粘性較大，裝料量過多，不利于通氣和散熱。反之，通氣良好，但是水分蒸發(fā)過快。裝料量低于30g時(shí)，酵母菌數(shù)隨裝料量的增加而增加，高于30g時(shí)，隨著裝料量的增加，反而對酵母生長產(chǎn)生相對抑制作用（圖2）。故選擇30g為最適裝料量。

固態(tài)發(fā)酵，水分是一個(gè)關(guān)鍵因素。水分過高，基質(zhì)密度大、不疏松，影響供氧。反之，水分蒸發(fā)過快。水料比低于1.25時(shí)，隨著比值的增大，活菌數(shù)快速增加，比值超過1.25后，菌數(shù)略有下降（圖3）。故水料水比以1.25為最佳。

接種量過大，不僅造成菌種資源的浪費(fèi)，而且使得培養(yǎng)基內(nèi)的水分相應(yīng)偏高，基質(zhì)粘連，不利于酵母生長。反之過低，致起始生物量低，降低增殖速度，延長發(fā)酵周期。

由圖4知，接種量達(dá)1.25×108后，活菌數(shù)增長緩慢，繼續(xù)增加接種量，菌體增長受到抑制（圖4）。故選取1.0×108CFU/g作為最適接種量。在一定范圍內(nèi)，溫度的升高有利于酵母的生長繁殖及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，但是溫度過高，導(dǎo)致酶類失活，甚至直接導(dǎo)致菌體死亡。反之，菌體生長緩慢，周期延長。由圖5知，最適溫度為30℃。

pH值是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，它通過影響菌體細(xì)胞膜的通透性，來改變酵母對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以及影響酵母自身酶系的活力。釀酒酵母的最適生長pH值為4.2～5.0，實(shí)驗(yàn)表明pH4.5為最佳（圖6）。

綜上所述，以黃酒糟生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物的最佳發(fā)酵工藝為：糖化酶100U/g，裝料量30g，水料比1.25，接種量1.0×108CFU/g，溫度30℃，pH4.5、此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物烘干后活菌數(shù)為20.88×108億/g。

2.2 營養(yǎng)成分對比

經(jīng)發(fā)酵后的酵母培養(yǎng)物，其蛋白及多肽含量增加，營養(yǎng)價(jià)值提高，具體為（表1）：粗蛋白含量為46.55%，增加了10.77%；多肽含量為6.97，增加了3.03%；粗脂肪為9.51%，略提高了2.32%；還原糖含量為10.56%，大幅度增加了7.6%；粗淀粉含量為11.78%，大幅度降低了25.84%；粗纖維為4.46%，略降低了0.28%；灰分含量為4.57%，增加了1.76%。

如圖7所示，黃酒糟經(jīng)發(fā)酵，自溶制備成酵母培養(yǎng)物之后，酸溶性蛋白平均分子量降低，檢測到更多的多肽和游離氨基酸。多肽和氨基酸是食品中的功能成分，具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等多種功效。

目前，市場上的酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品有：達(dá)威農(nóng)公司的“益康XP”，粗蛋白12%，粗纖維6.50%，粗脂肪3%，灰分5%；安琪酵母有限公司生產(chǎn)的“酵母自溶粉FM801”，粗蛋白含量約為40%，灰分12%；湖北高生生物飼料有限公司生產(chǎn)的“方祥益思特酵母培養(yǎng)物”，粗蛋白22.60%，多肽5%，粗纖維7.80%，灰分6.70%。本產(chǎn)品以黃酒糟為基質(zhì)，在材料來源上與他們沒有可比性，但其粗蛋白和多肽含量較高，酵母活菌數(shù)達(dá)20.88×108億/g。由此可見，黃酒糟生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物具有一定的優(yōu)勢，深層次挖掘其發(fā)酵工藝，作為蛋白飼料和功能性飼料添加劑，其前景廣闊。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)的主要創(chuàng)新點(diǎn)如下：

（1）提出了酒糟利用的一種潛在的途徑，制備酵母培養(yǎng)物，既可以作為飼料蛋白，又可以作為動物益生因子。單純利用黃酒糟作為飼料蛋白，產(chǎn)品附加值低，只利用于黃酒糟富含蛋白質(zhì)的特性。而作為酵母培養(yǎng)物，不僅可以使其蛋白質(zhì)得到利用，而且使其功能發(fā)揮到極致，如多肽及氨基酸含量提高，酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物等益生因子釋放得以利用。

（2）確定了最佳發(fā)酵工藝條件，糖化酶100U/g，裝料量30g，水料比1.25，接種量1.0×108CFU/g，溫度30℃，pH4.5，此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物烘干后活菌數(shù)為20.88×108億/g，蛋白質(zhì)含量提高。與市場上酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品相比，各有優(yōu)勢。

（3）固態(tài)發(fā)酵，酶解破壁工藝相結(jié)合，取長補(bǔ)短，相得益彰。通常，生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物過程如下：液態(tài)發(fā)酵，厭氧酵母自溶，谷物吸附及烘干。此工藝周期長，需要長時(shí)間的厭氧條件細(xì)胞壁才裂解并釋放營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)液態(tài)發(fā)酵能耗較高。而本工藝采用固態(tài)發(fā)酵富集菌體，簡便易行；然后，采用廉價(jià)的常用酶類裂解酵母細(xì)胞壁，使代謝產(chǎn)物被釋放出來，得到酵母培養(yǎng)物。

[責(zé)任編輯：湯靜]