限制性胎盤嵌合體對產前診斷的影響

周希亞，戚慶煒，郝娜，周京，劉俊濤，邊旭明

（中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院，北京 100730）

限制性胎盤嵌合體（CPM）是指胎盤內同時存在染色體正常和異常的細胞系，而胎兒染色體正常的情況。在早孕期絨毛活檢（CVS）操作中，CPM 的發生率為1%～2%［1－2］，其中30%～50%的CPM會在妊娠過程中丟失胎盤非整倍體細胞系［3］。而在異常細胞持續存在的病例中，CPM可能會增加不良妊娠結局的風險。雖然最早的CPM報道距今已有30余年［1］，但我國文獻中對CPM的系統研究及報告仍很鮮見［4－5］。本文回顧性分析了我院2013年早孕期絨毛活檢中發現的2例CPM患者，參考近年來國內外的相關文獻報道，探討CPM的發生、妊娠結局、產前咨詢與隨訪處理，及其對無創產前檢測（NIPT）、植入前遺傳學篩查（PGS）的影響。

資料與方法

一、研究對象

對2013年我院產科收治的存在高齡妊娠、胎兒頸部透明層增厚、染色體異常胎兒分娩史的211例妊娠婦女行經腹CVS檢查，發現2例CPM患者，CPM發生率為0．9%。此2例患者的產前診斷情況見表1。

表1 CPM患者的產前診斷情況

CPM的產前診斷：采用絨毛長期培養法［4］，進行G顯帶核型分析，如發現絨毛標本嵌合，再經后續羊膜腔穿刺或臍血穿刺確認，診斷為CPM。

二、研究方法

1．CVS操作：穿刺前認真核對適應證、妊娠周數、子宮大小、有無穿刺禁忌證等。B超測量胎兒頭臀長以核對孕周，了解有無胎心，定位胎盤位置，選擇穿刺部位。在超聲引導下，選用雙針套管，將引導套針經腹壁及子宮穿刺入胎盤。拔出針芯，將活檢針經引導套針內送入胎盤絨毛組織。連接含有2～4ml生理鹽水的20ml注射器，以5ml負壓上下移動活檢針吸取絨毛組織。拔針后立即觀察胎盤部位有無出血及胎心情況。

2．絨毛培養及染色體制備：無菌條件下，用無菌生理鹽水將絨毛組織洗凈，去除紅細胞及蛻膜組織、非絨毛組織。用無菌剪刀剪碎組織后，加入1ml酶解液（自配，含 0．02%EDTA、0．25% 胰酶和900U／ml的膠原酶），吹打均勻后置于37℃水浴中20～30min，取出后進行離心操作，棄上清后，加入Amniomax培養液（GIBCO，美國）4ml，混勻后置于培養瓶中，37℃CO2培養箱中培養2～3d，至有貼壁細胞并形成多個克隆后即采用原位法收獲細胞。

每個培養瓶中加入20μl類秋水仙素溶液（GIBCO，美國），調整終濃度為25μg／ml，室溫或37℃水浴中作用15min，倒掉液體加入1%枸櫞酸鈉溶液（自配）4ml，室溫或37℃水浴中低滲作用40min，加入1ml 3∶1固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1，自配）預固定2min，倒掉液體后，加入1．5ml 3∶1固定液涮壁后倒掉，重新加入固定液4ml作用20min，倒掉液體后再加入固定液4ml作用10min，此步驟重復一次后將培養瓶上蓋掀掉、甩出液體即可烤片，進行染色體分帶染色。

3．羊水細胞培養及染色體制備：在B超引導下經腹抽取羊水20ml，離心后棄上清，每管加入1ml Amniomax培養液后混勻，將細胞懸液分別加入4個帶玻片平皿中的蓋玻片上（每個0．5ml），置于CO2培養箱中培養24h后，向每個平皿中追加1．5ml培養液繼續培養72h。此后每天顯微鏡下觀察細胞形態，觀察到較好的梭形細胞克隆時更換培養液，于24h后收獲細胞。

向每個平皿中加入20ng／ml秋水仙素12μl，置于37℃培養箱中繼續培養2h，棄去培養液，加入0．8%枸櫞酸鈉溶液2ml進行低滲，37℃培養箱中繼續培養20～30min后在相差顯微鏡下觀察，若細胞透亮渾圓，則緩慢加入3∶1固定液逐步固定。室溫下控干后置于55℃加熱平臺上烤片，再置于37℃溫箱中過夜，最后用樹脂膠將蓋玻片貼在干凈的載玻片上備用。在0．25%胰酶溶液中作用15s后Gi－emsa染色，濾紙吸干多余水分后顯微鏡下觀察。

4．單核苷酸多態性微陣列分析：采用美國Affymetrix公司的Cytoscan 750K芯片平臺進行單核苷酸多態性微陣列分析。取600μl新生兒外周血采用德國QIAGEN公司試劑盒及其標準DNA抽提方法提取DNA，并測定樣本濃度。經酶切、連接、聚合酶鏈反應（PCR）、PCR產物鑒定、純化、定量、片段化、標記、雜交后，對芯片進行洗滌、染色及掃描，得到數據經Affymetrix自帶軟件轉換，并通過染色體分析軟件ChAS（Chromosome Analysis Suite Software）進行分析。

結 果

一、2例患者的培養及核型分析結果

患者1絨毛培養及核型分析結果顯示為15－三體與正常核型的嵌合，羊水細胞培養及核型分析則僅見1個核型15－三體。患者2絨毛培養及核型分析結果顯示7－三體與正常核型的嵌合，臍血穿刺及核型分析結果未見異常。

臨床分析認為患者1不能除外假性嵌合或低水平的真性嵌合，CPM可能性大；嵌合為單親二倍體的診斷帶來困難，經遺傳咨詢后，該例患者選擇繼續妊娠。患者2CPM診斷明確，經遺傳咨詢后，選擇繼續妊娠。

二、CPM的妊娠結局

患者1于孕38周4d剖宮產1女性活嬰，Apgar評分10分，新生兒體重3 220g。經知情同意后，取新生兒外周血培養并行400～450條帶核型分析，未見異常核型。單核苷酸多態性微陣列分析結果為arr（1－22）x2，XYx1。

患者2孕32周時發現胎兒宮內生長受限，定期B超監測胎兒生長發育情況，維持妊娠至37周2d剖宮產1男性活嬰，Apgar評分10分，新生兒體重2 340g，為小于胎齡兒，轉兒科處理。取胎盤多點樣本，行320條帶染色體分析，胎盤邊緣100%為47，XY＋7，胎盤中央近胎兒面100%為46，XY，胎盤近臍帶根部母體面細胞25%為47，XY＋7，75%為46，XY。

討 論

一、CPM的發生

1983年，Kalousek和Dill發現，在不明原因宮內發育受限的嬰兒的胎盤中存在CPM［1］。理論上，由于胎盤與胎兒來自同一受精卵，其染色體核型應當一致。但是在CPM的病例中，異常染色體核型（數目或結構異常）的細胞系僅存在于胎盤，而胎兒核型正常［2］。

目前，CPM的分類有以下兩種情況，一是根據發生機理，CPM可以分為減數分裂型及有絲分裂型：減數分裂型是指受精卵染色體異常（通常為三體），在之后的分裂中，由于“錯誤”導致囊胚內細胞團中形成胚胎的細胞丟失了異常染色體，成為46，XN，而其余的異常細胞被“驅趕”至滋養細胞層，這個過程被稱為“三體合子挽救”（trisomic zygote rescue）或“胎兒自救”（fetal rescue）；有絲分裂型則是指受精卵為二倍體，異常分裂發生在胎盤細胞的前體中。另一種是按照所累及的絨毛細胞，CPM可以分為3型：Ⅰ型CPM，染色體異常只存在于細胞滋養細胞，因此僅在短期培養后能見到；Ⅱ型CPM，染色體異常局限于絨毛的間質核心，只有經過長期培養后方可見到；Ⅲ型CPM，染色體異常既存在于細胞滋養細胞，也存在于間質核心，短期培養和長期培養后均可見到［6］。因此對絨毛同時進行短期培養和長期培養，可以更準確地診斷CPM及其分型。本研究中，由于取材量的限制，我院采用的是長期培養法，故未能對CPM進行準確分型。有研究報道，妊娠9～12周時通過CVS進行產前診斷的病例中，CPM的發生率約為1%～2%［1－2］，而普通人群中 CPM 的真實發生率目前尚不清楚。16－三體是CPM中最常見的非整倍體，其他常見的非整倍體包括2、7、9、15和22號染色體三體［6］。

二、CPM的妊娠結局

繼Kalousek和Dill發現CPM與胎兒宮內生長受限相關后，許多學者希望能證實這一相關性，但研究結果并不一致。有研究發現CPM與不良妊娠結局有關，包括流產、胎兒宮內生長受限、早產等［7－12］，而另一些研究則未能證實CPM導致不良妊娠結局［13］。有學者對不明原因的胎兒宮內生長受限進行了研究，發現 CPM 的比例顯著增高［8－10］，但大多數研究仍集中于早孕期CVS診斷的CPM病例，未發現分娩孕周、新生兒體重在CPM組與對照組間存在統計學差異。表2展示了部分文獻病例對照研究的結果。

表2 CPM對妊娠結局影響的部分病例對照研究

研究結果的不一致，一方面可能是因為大多數研究樣本量較小，研究結果存在一定的偏倚；另一方面可能因為CPM對胚胎及胎兒發育的影響與諸多因素有關，包括染色體受累的時間、染色體異常的類型、受累染色體本身的性質，以及足月胎盤的嵌合比例等。有研究報道，Ⅰ型CPM患者往往出現流產或胎兒宮內生長受限［7］；有些染色體異常容易造成自然流產，表明這些染色體的CPM可能是減數分裂型，例如16－三體的 CPM［1］；而另一些染色體的CPM可能是有絲分裂型，例如8－三體的CPM［1］。此外，并非所有早孕期CVS診斷的CPM患者都能維持到妊娠足月，足月胎盤是否仍存在嵌合以及嵌合程度可能與妊娠結局相關。有研究發現，9號、16號染色體三體／二倍體嵌合的CPM患者最易維持至足月［6］。Wilkins－Haug等［14］對70例胎兒宮內生長受限的病例進行病例對照研究發現，胎兒宮內發育受限的患者其胎盤存在高水平的四倍體嵌合。因此，要想準確解釋CPM對妊娠結局的影響，必須對足月胎盤進行全面地分析。在缺乏胎盤染色體結果的情況下，很難評價CPM與妊娠結局之間的關系。對于不明原因的胎兒宮內生長受限，建議在分娩時留取多點胎盤組織進行染色體分析。本研究中我院2013年僅收集到的2例CPM患者中，病例2存在胎兒宮內生長受限，胎盤多點染色體分析證實了妊娠足月時胎盤依舊存在嵌合狀態。

三、CPM的咨詢與隨訪

CVS檢查所取標本為早孕期胎盤絨毛，主要為細胞滋養細胞及絨毛間質，并非真正的胎兒組織。因此，當CVS檢查發現嵌合時，首先應分析胎兒真性嵌合的可能性。例如，CVS檢查發現21－三體嵌合，表示胎兒也可能存在21－三體，無論胎兒本身是否為嵌合體。8、9、12、13、15、18和20－三體的嵌合也存在類似風險。而CVS檢查發現2、3、5、7、10、11、14、16、17－三體嵌合時，胎兒核型往往并無異常［15］。

對于減數分裂型CPM，三體受精卵“胎兒自救”過程中會丟失掉一條染色體，因此剩余的兩條染色體有可能來自同一個親本，即出現單親二體（UPD）。因此，對于那些可能存在印記基因的染色體，例如當發現涉及5、6、7、9、11、14、15、16號染色體的 CPM 時，應當進行 UPD 檢測［16－17］。

當CVS核型分析提示嵌合體結果時，遺傳咨詢首先應分析CPM的可能性。告知孕婦絕大多數的嵌合并不意味著胎兒異常，應當進行羊膜腔穿刺或臍血穿刺再次進行核型分析；但另一方面也應說明，即使后續診斷核型正常，胎兒仍可能存在低水平的嵌合，但不一定影響表型。Stetten等［18］隨訪了29例CPM患者的新生兒，其中2例存在低水平的嵌合。由于CPM與妊娠結局之間的關系比較復雜，妊娠期間難以預測，因此，對CPM患者胎兒的生長發育應予以重視，對宮內生長受限的胎兒應加強大腦中動脈及臍動脈血流的監測，并適時終止妊娠。產后應對胎盤及新生兒進行染色體分析。

四、CPM對新技術的挑戰

隨著測序技術的發展，近年來，母血胎兒游離DNA被用于胎兒非整倍體檢測，即無創產前檢測技術（NIPT）。但有研究發現，CPM是造成NIPT檢測假陽性的重要因素［19－23］。因為所謂的胎兒游離DNA，并非來自胎兒，而是來自胎盤細胞。胎盤嵌合體的存在，將導致假陽性結果的發生，表3列出了CPM導致NIPT檢測假陽性的部分研究（截至2013年）。因此，在獲得NIPT結果后，建議再行羊膜腔穿刺或臍血穿刺進行產前診斷。

表3 CPM導致NIPT檢測假陽性的部分研究

近年來，植入前遺傳學篩查技術（PGS）也逐漸發展。van Echten－Arends等［24］研究報道，行 PGS檢測的卵裂球中，59%是二倍體／非整倍體的嵌合體。Northrop等［25］研究報道，16%的囊胚為嵌合體。由于植入前高比例的嵌合，在PGS過程中，采用極體、第3天卵裂球中的單個細胞、或者囊胚滋養細胞層（將來形成胎盤）的多個細胞，都有可能導致PGS認為二倍體的胎兒為非整倍體，從而被錯誤地排除。

到目前為止，CVS核型分析的嵌合狀態仍是產前診斷和咨詢中的難點。CPM的發生率較低，需要通過羊膜腔穿刺或臍血穿刺、核型分析診斷。對于某些染色體而言，診斷CPM時要除外UPD的存在。CPM可能造成NIPT、PGS的假陽性結果，因此，NIPT檢測陽性仍需核型診斷。由于CPM可能對產前診斷造成上述影響，臨床醫生應當重視CPM的存在，加強對CPM的遺傳咨詢。對于存在CPM的妊娠，孕期應加強對胎兒生長發育的監測，分娩時留取胎盤多點取材，分別檢測染色體核型。

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