低頻低能量超聲聯合微泡對前列腺細胞的影響

陳旖旎，白文坤，胡兵

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低頻低能量超聲聯合微泡對前列腺細胞的影響

陳旖旎，白文坤，胡兵

(上海交通大學附屬第六人民醫院超聲醫學科，上海超聲醫學研究所，上海 200233)

目的：采用原子力聲顯微鏡及透射電鏡觀察低頻低能量超聲聯合微泡對前列腺癌細胞DU145及正常前列腺上皮細胞RWPE-1的作用。方法：兩種細胞均分為對照組、單純超聲組、超聲聯合微泡組。對照組加入一定比例的生理鹽水，不進行超聲輻照；單純超聲組加入相同比例的生理鹽水，用發射頻率為21 kHz的低頻超聲輻照，輻照2 min，占空比30%；超聲聯合微泡組加入同前相同比例的微泡造影劑懸濁液，用與單純超聲組相同的超聲輻照。處理過的細胞立即用原子力聲顯微鏡觀察其形貌并計算其楊氏模量。同時，對同一處理方式的對照組及超聲聯合微泡組細胞繼續培養24 h后，用透射電鏡觀察細胞。結果：單純超聲組的DU145細胞及RWPE-1細胞的細胞形態與對照組無明顯變化；超聲聯合微泡組的DU145細胞及RWPE-1細胞形態呈類圓形，細胞表面可見放射狀顯微絲狀結構，細胞膜表面可見多個大孔狀結構；超聲聯合微泡組的DU145細胞的彈性模量較RWPE-1細胞大，且與對照組相比，兩種細胞的彈性模量均變大，DU145細胞尤甚。透射電鏡觀察結果示對照組的兩種細胞未見細胞自噬，而超聲聯合微泡組兩種細胞都出現自噬現象，其中DU145細胞中可見凋亡現象。結論：低頻低能量超聲聯合微泡可引起前列腺癌DU145細胞及正常前列腺上皮RWPE-1細胞的細胞膜出現孔狀結構，并誘導其自噬，且對DU145細胞的損傷大于RWPE-1細胞。

低頻低能量超聲；微泡造影劑；前列腺癌；原子力聲顯微鏡；細胞自噬

0 引言

近年來，低頻超聲被廣泛應用于疾病治療中。

許多學者研究了低頻、低能量超聲聯合微泡對腫瘤的作用[1-3]后發現，低頻、低能量超聲聯合微泡可誘導某些腫瘤細胞的自噬及凋亡。

前列腺癌是發病率較高的男性惡性腫瘤。在美國，占男性癌癥死因的第二位[4]。大多數患者經治療后由激素敏感性變為激素抵抗性，成為激素非依賴性或難治性前列腺癌[5]。本實驗擬用原子力聲顯微鏡及電鏡觀察低頻低能量超聲聯合微泡對激素非依賴性人前列腺癌細胞系DU145及正常永生化的前列腺上皮細胞系RWPE-1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺癌細胞株DU145(科院細胞庫)及前列腺正常上皮細胞系RWPE-1(上海生博生物醫藥科技有限公司)；超聲波治療儀由超聲波發生器、單路功放及圓形平面換能器組成，輸出功率可調，本實驗發射頻率為21 kHz，直徑為13 mm；Veeco DI 3100型原子力顯微鏡，探針型號1：SICON-200，彈性常數為0.02~0.8 N／m，諧振頻率為5~25 kHz；探針型號2：ACT-200，彈性常數為25~75 N／m，諧振頻率為200~400 kHz；壓電片；HiRox (KH-7700)數字體式顯微鏡；微泡使用Bracco公司聲諾維，為SF6微泡，直徑為2~8 μm，使用前生理鹽水5 ml稀釋振蕩；其他試劑及儀器：角化細胞-SFM，重組上皮生長因子1-53 (EGF 1-53)，牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extract, BPE)(Gibco，美國)；1640培養液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；0.25％胰酶(Gibco，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞樣本制備方法

DU145細胞培養在含10%胎牛血清的1640培養液中，37℃、5％CO2培養箱中培養，每2~3天傳代一次；RWPE-1細胞培養在K-SFM(500 ml內含有25 mg BPEJ及2.5 μg EGF)中，37 °C、5％CO2培養箱中培養，每2~3天傳代一次；以蓋玻片為細胞黏附底物，玻片邊長21 mm，透明白色，硼硅玻璃。蓋玻片在乙醇中浸泡15 min后，取用無菌PBS溶液稀釋過的濃度為100 μg/ml多聚賴氨酸0.25 ml，滴在準備好的無菌蓋玻片上4 °C過夜，使多聚賴氨酸黏附在蓋玻片上。第二天吸去多余的多聚賴氨酸溶液，把蓋玻片用無菌蒸餾水浸洗兩次。空氣干燥并紫外線照射15 min后使用。將蓋玻片置于六孔培養板中，各加入濃度為1×106個/ml的細胞1 ml，按照上述方法培養。將DU145與RWEP-1細胞按不同處理方法各分為三組：對照組、單純超聲組及超聲聯合微泡組。

1.2.2 超聲輻照方法

室溫下，將超聲探頭固定于不銹鋼支架上，輻射面垂直向上，將裝有蓋玻片的六孔板的一個孔的中心置于超聲換能器表面，板與換能器間涂有耦合劑，聲強為0.113 W/cm2，占空比為30%，對于對照組，輻照0 min，加入相應的細胞培養液(100 μl/ml)；對于單純超聲組，輻照2 min，加入相應的細胞培養液(100 μl/ml)；對超聲聯合微泡組，輻照2 min，超聲作用前向培養液內加入配置好的微泡懸液(100 μl/ml)。

1.2.3 原子力聲顯微鏡(Atomic Force Acoustic Microscope, AFAM)觀察

(1) 細胞表面形貌的觀察。超聲輻照處理后即刻觀察。細胞表面用1號探針形貌掃描。對于對照組直接取出蓋玻片，用滴管取蒸餾水沖洗玻片3次，干燥后置于AFAM試樣臺上，在接觸模式下調節各項參數并下針掃描；單純超聲組超聲輻照后觀察；超聲聯合微泡組加入微泡超聲輻照后，按照同樣方法觀察以獲得細胞表面形貌像。

(2) 液態環境下用2號探針測量細胞的彈性模量。對于對照組直接取出蓋玻片，蓋玻片上滴上培養液，放置于AFAM試樣臺上，對細胞核中心區域作力曲線，設置懸臂梁最大彎曲量即Trigger Threshold為150 nm，采用Ramp Plot得到力曲線；對于單純超聲組，按照前述方法進行超聲輻照后取出按照同樣方法觀察；對于超聲聯合微泡組，加入微泡后按照前述方法進行超聲輻照后取出按照同樣方法觀察。每組選取五個細胞。得到力曲線圖后，為了減小黏附性對彈性模量(楊氏模量)產生的誤差，選用逼近力曲線，并沿用前人在試驗過程中采用公式的Hertz接觸模型計算彈性模量(楊氏模量)[6]。

1.2.4 透射電鏡

各組細胞輻照后放置24 h，用細胞刮將玻片上的細胞刮下，將培養液離心，制備超薄切片后在透射電鏡下觀察。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 AFAM細胞形態觀察

原子力聲顯微鏡掃描時是結合了光學顯微鏡，挑選出目標細胞進行掃描。如圖1所示，A1~C1及A2~C2分別為對照組、單純超聲組、超聲聯合微泡組的DU145細胞的形貌圖像及三維立體圖像。對照組的細胞形態橢圓，細胞膜光滑完整，細胞核居中；單純超聲組細胞形態相對飽滿，細胞膜光滑完整，細胞膜表面可見細小的孔狀結構，直徑約1 μm；超聲聯合微泡組的細胞呈圓形，細胞膜似不完整，可見放射狀纖維樣物質，細胞表面有多個孔狀結構，直徑約5 μm。如圖2所示，D1~F1及D2~F2分別為對照組、單純超聲組、超聲聯合微泡組的RWPE-1細胞的高度圖像及三維立體圖像。對照組細胞呈長橢圓形，細胞膜光滑完整，細胞核居中，細胞間見顯微結構相連；單純超聲組細胞呈長橢圓形，膜光滑完整；超聲聯合微泡組細胞呈類圓形，細胞表面可見放射狀顯微絲狀結構，細胞膜表面可見多個大孔狀結構，直徑約6 μm。

2.2 AFAM液態環境下測量細胞的楊氏模量

細胞表面形貌成像后對細胞核中心區域作力曲線，運用公式計算其楊氏模量。對數據進行檢驗。DU145細胞及RWPE-1細胞的超聲聯合微泡組的楊氏模量與各自對照組相比，差異有統計學意義(=0.02、=0.048)；DU145細胞及RWPE-1細胞的單純超聲組與對照組的楊氏模量均無統計學差異(=0.121、=0.542)；RWPE-1細胞的超聲聯合微泡組的楊氏模量與單純超聲組楊氏模量差異有統計學意義(=0.02、=0.09)；DU145細胞與RWPE-1細胞的對照組細胞的楊氏模量差異有統計學意義(=0.042)；DU145細胞與RWPE-1細胞的超聲聯合微泡組細胞的楊氏模量差異無統計學意義(=0.199)。細胞的楊氏模量均數及標準差如表1所示。

表1 細胞的楊氏模量均數及標準差±s

Table 1 Mean and standard deviation of cell Young's modulus

表1 細胞的楊氏模量均數及標準差±s

細胞類型對照組單純超聲組超聲聯合微泡組 DU14537.00±6.4446.80±9.7871.20±7.85 RWPE-156.00±12.8252.20±8.9276.20±4.76

2.3 透射電鏡觀察細胞自噬

將DU145細胞及RWPE-1細胞的空白對照組及低頻低能量超聲聯合微泡組細胞進行透射電鏡觀察。空白對照組的DU145細胞和RWPE-1細胞的細胞膜完整，細胞核無變化；DU145的低頻低能量超聲聯合微泡組細胞的細胞膜完整，細胞核未見明顯改變，胞質內見多個囊樣結構，內包裹部分細胞器，部分囊狀結構為自噬泡，部分為自噬溶酶體。經過低頻低能量超聲聯合微泡處理過的DU145細胞可見部分細胞出現細胞質濃縮，細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化，呈細胞凋亡的表現，而超聲聯合微泡組的RWPE-1細胞未見此表現。

3 討論

本實驗用原子力聲顯微鏡及電鏡觀察低頻低能量超聲聯合微泡對前列腺癌細胞系DU145及正常前列腺上皮細胞系RWPE-1的作用。原子力聲顯微鏡可對細胞表面形貌進行納米分析并測量細胞彈性。其可直接掃描細胞，從而避免了細胞制備過程中的復雜步驟，并可對活細胞進行觀察[7]。本研究中，通過其對各組細胞的分析(圖1及圖2)發現，單純超聲作用后細胞的表面形貌變化不明顯，而超聲聯合微泡組細胞形態飽滿，細胞表面出現直徑約5~6 μm的孔狀結構，部分細胞包膜外見放射狀的顯微絲狀結構。通過液相下接觸模式，同時對各組細胞的彈性模量進行了測量。從數據可以得出前列腺癌DU145細胞相比正常的前列腺上皮細胞彈性大，單純超聲作用后細胞彈性模量變化不顯著，而超聲聯合微泡作用后兩種細胞彈性都變小，且超聲聯合微泡作用后的前列腺癌細胞較正常前列腺上皮細胞變化幅度更大，這可能與超聲聯合微泡作用后細胞內微絲變化有關[8-10]，在一定范圍內，細胞硬度增加可能表明細胞受到了損傷[11]，這可能表示超聲聯合微泡對Du145細胞的作用強于RWPE-1細胞。在觀察到單純超聲對細胞作用不明顯后，采用透射電鏡觀察對照組及超聲聯合微泡組細胞的變化，可見DU145細胞及RWPE-1細胞在超聲聯合微泡作用后都出現了自噬現象(見圖3)。自噬作為細胞在應激反應時機體所發生的一種適應性變化，在營養條件充足時，基本不出現在細胞中。自噬的發生常常有利于細胞生存，因為自噬的基本功能是將細胞的某些結構降解后再利用為細胞提供能量和物質[12,13]。可推測超聲聯合微泡對細胞造成損傷后，細胞通過自噬自我修復，而自噬的發生于細胞膜表面出現的孔狀結構，是否由于部分膜蛋白的改變而誘導，還需要進一步的實驗探索。同時在超聲聯合微泡作用后的DU145細胞中發現部分細胞出現細胞質濃縮，細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化，呈細胞凋亡的表現[14]，而RWPE-1細胞中未見明顯凋亡細胞，同時綜合考慮超聲聯合微泡作用后它們的彈性模量的變化，我們可以得出超聲聯合微泡對DU145細胞的作用大于RWPE-1細胞。

圖3(a) 對照組的Du145細胞的透射電鏡圖像

Fig.3(a) TEM images of DU145 cell in control group

圖3(b) 對照組的RWPE-1細胞的透射電鏡圖像

Fig.3(b) TEM images of RWPE-1 cell in control group

圖3(c) 超聲聯合微泡組的Du145細胞的透射電鏡圖像，圖中可見自噬溶酶體或自噬泡(箭頭所示)

Fig.3(c) TEM images of DU145 cell treated with ultrasound combined with microbubbles, showing autophagy lysosome or autophagic vacuoles (arrows)

圖3(d) 超聲聯合微泡組的RWPE-1細胞的透射電鏡圖像，圖中可見自噬溶酶體或自噬泡(箭頭所示)

Fig.3(d) TEM images of RWPE-1 cell treated with ultrasound combined with microbubbles，showing autophagy lysosome or autophagic vacuoles (arrows)

從實驗結果可以得出，低頻低能量超聲聯合微泡可以引起前列腺癌DU145細胞及前列腺正常上皮細胞RWPE-1的自噬，使細胞彈性模量發生改變，且誘導了DU-145凋亡，但卻未誘導正常前列腺上皮細胞發生凋亡，低頻低能量超聲聯合微泡似乎是潛在的治療前列腺癌的新方法。

4 結論

綜上，低頻低能量超聲聯合微泡可引起前列腺癌DU145細胞及正常前列腺上皮RWPE-1細胞的細胞膜出現孔狀結構，并誘導其自噬，且對DU145細胞的損傷大于RWPE-1細胞。

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The effect of low-frequency ultrasound combined with microbubbles on human prostate cells

CHEN Yi-ni, BAI Wen-kun, HU Bing

(Department of Ultrasound in Medicine, The 6th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine, Shanghai 200223, China)

Objective: To explore the impact of 21 kHz low-intensity ultrasound combined with microbubbles on both DU145 cells and RWPE-1 cells by using Atomic force acoustic microscope (AFAM) and Transmission electron microscopy (TEM). Methods: Both DU145 cells and RWPE-1 cells were divided into three groups: control group, ultrasound group and ultrasound combined with microbubbles group. Conditions of the low-frequency and low-energy ultrasound (US) irradiation were: Frequency, 21 kHz; Exposure time, 2 min at a duty ratio of 30%; and the valid treatment time of 84 seconds was used for the combination with microbubbles (100μl/ml). Cells of different groups were imaged in cover slips by AFAM immediately after the intervention. Twenty-four hours after intervention, TEM was used to observe cells. Results: Cellular membrane and three-dimensional structure of both cells showed significant difference in ultrasound combined with microbubbles group compared with control group, while no difference in ultrasound group compared with control group. Compared with control group, the elasticity modulus of both cells in ultrasound combined with microbubbles group was higher, and also the elasticity modulus of DU145 cells was higher than RWPE-1 in ultrasound combined with microbubbles group. Lots of autophagosomes or autolysosomes were detected by TEM in both cells in ultrasound combined with microbubbles group. TEM also demonstrated some apoptosis of DU145 cells in ultrasound combined with microbubbles group. Conclusions: The low-frequency ultrasound combined with microbubbles can induce autophagy in both DU145 cells and RWPE-1 cells, and the injury to DU145 cells is more serious than to RWPE-1 cells.

low-frequency ultrasound;microbubble contrast agent;prostate cancer;Atomic Force Acoustic Microscope(AFAM);autophage

TB566

A

1000-3630(2015)-04-0333-05

10.16300/j.cnki.1000-3630.2015.04.008

2014-12-23;

2015-02-17

國家自然科學基金項目(81401421)、教育部項目(20120073120100)、上海市科委自然基金面上項目(12ZR1422600)資助。

陳旖旎(1989－), 女, 福建建甌人, 碩士研究生, 研究方向為原子力聲顯微鏡的應用。

胡兵, E-mail: binghu_stephen@163.com