苯腎上腺素對大鼠成骨細胞放射損傷的保護作用

韓立赤，王雪紅，董　會，汪義菲，張福胤，向　彬

(1.大連大學醫學院口腔醫學系，遼寧 大連 116622；2.大連醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科，遼寧 大連 116011；3.大連醫科大學附屬第二醫院口腔頜面外科，遼寧 大連 116023)

苯腎上腺素對大鼠成骨細胞放射損傷的保護作用

韓立赤1，王雪紅1，董會2，汪義菲1，張福胤3，向彬1

(1.大連大學醫學院口腔醫學系，遼寧 大連 116622；2.大連醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科，遼寧 大連 116011；3.大連醫科大學附屬第二醫院口腔頜面外科，遼寧 大連 116023)

目的：探討苯腎上腺素對放射損傷大鼠成骨細胞的細胞形態以及煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt)mRNA表達水平的影響，闡明苯腎上腺素對其可能的保護作用機制。方法：組織塊法培養大鼠顱骨成骨細胞，隨機分為空白對照組、苯腎上腺素組、單純照射組和苯腎上腺素+照射組。苯腎上腺素組在照射前0.5 h以100 mmol·L-1苯腎上腺素孵育成骨細胞，照射組給予成骨細胞8 Gy X射線照射。照射后8、16、32和64 h在倒置顯微鏡下觀察并分別收集細胞，提取細胞總RNA，應用RT-PCR法檢測成骨細胞Nampt mRNA表達水平。結果：倒置顯微鏡下，與空白對照組比較，苯腎上腺素組成骨細胞形態、數量未見明顯改變；單純照射組細胞形態發生明顯皺縮，尤以8 h明顯，細胞數量在8、16、32和64 h時分別是對照組的0.82、0.37、0.24和0.21倍；苯腎上腺素+照射組在照射8和16 h后細胞皺縮，32 h后其形態恢復，在8、16、32和64 h后其數量分別為空白對照組的0.91、0.83、0.72和0.75倍，是單純照射組的1.09、2.24、3.00和3.60倍。RT-PCR法檢測，在照射8、16、32和64 h后，單純照射組、苯腎上腺素+照射組Nampt mRNA表達水平較空白組明顯減少(P<0.01)，苯腎上腺素+照射組較單純照射組明顯增加(P<0.01)。結論：苯腎上腺素可減輕電離輻射導致的大鼠成骨細胞萎縮，并上調Nampt mRNA表達水平，其對成骨細胞放射損傷的保護作用可能與上調Nampt mRNA表達水平有關。

成骨細胞；電離輻射；苯腎上腺素；煙酰胺磷酸核糖轉移酶

放射治療為頭頸部惡性腫瘤治療的主要手段之一。放射治療時X射線在殺傷惡性腫瘤細胞的同時，亦可引起頜骨組織纖維化、放射性骨壞死和病理性骨折等并發癥，嚴重影響患者生活質量[1-2]。臨床對上述并發癥多采用高壓氧、藥物及手術等方法治療[3-4]，但療效并不令人滿意。本課題組前期研究[5-6]結果顯示：苯腎上腺素通過活化α1-腎上腺素受體(α1-adrenoceptor,α1-AR)對放射損傷的大鼠頜下腺具有細胞保護作用；然而，α1-AR對放射引起骨損傷的作用尚未見相關報道。煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成途徑的關鍵限速酶，通過調節機體或細胞的NAD+水平以及其他非酶機制等途徑影響代謝，炎癥反應，細胞的增殖、分化、凋亡和衰老等諸多過程[7-9]。苯腎上腺素對放射損傷的頜骨組織中Nampt的影響未見文獻報道。本研究通過研究苯腎上腺素對放射性損傷大鼠成骨細胞的作用及其對Nampt基因表達水平的影響，為探討防治放射性頜骨損傷的新方法提供依據。

1　材料與方法

1.1動物、主要試劑和儀器實驗用SD大鼠乳鼠由大連醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：0001648；胰酶、DMEM高糖培養液和優質胎牛血清(Hyclone公司，美國)，Trizol(Invitrogen公司，美國)，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司，美國)，2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司)；低溫高速離心機(型號：5417R，Thermo公司，美國)，倒置顯微鏡 (Olympus公司，日本)，直線加速器(型號：23EX，Varian公司，美國)，PCR儀(型號：TC-615，TECHNE公司，英國)，核酸/蛋白分析儀(型號：3S，Thermo BioMate公司，美國)。

1.2大鼠成骨細胞培養新生1～2 d齡SD大鼠乳鼠推頸處死，無菌條件下取顱蓋骨，去除骨膜及骨縫軟組織，用PBS緩沖溶液洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎片，均勻鋪于培養瓶底，間距約5 mm。輕輕將培養瓶翻轉，瓶底朝上放于37℃、5% CO2培養箱內；4 h后將培養瓶緩慢翻轉平放，向瓶內加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，靜止培養。倒置顯微鏡下觀察成骨細胞生長狀況。待細胞長滿培養瓶底80%以上，用0.25%胰酶消化傳代。

1.3大鼠成骨細胞鑒定原代成骨細胞至第7天傳代培養，倒置顯微鏡下觀察并攝片。鈣結節染色：取第3代大鼠成骨細胞培養20 d后，于蓋玻片上鏡下見細胞聚集成不透明區域，呈結節樣。取出蓋玻片，以95%乙醇固定10 min，0.1%茜素紅染色，37℃溫箱孵育30 min，蒸餾水沖洗，干燥，甘油明膠封片。

1.4實驗分組和處理將傳至第3代16瓶成骨細胞隨機分為4組：空白對照組、苯腎上腺素組、單純照射組和苯腎上腺素+照射組(照射前0.5 h給予終濃度為100 mmol·L-1苯腎上腺素)。應用直線加速器給予單純照射組和苯腎上腺素+照射組成骨細胞8 Gy X射線照射。

1.5成骨細胞形態和數目觀察在照射后8、16、32和64 h利用倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，比較不同時間點的細胞形態學及數目差別。

1.6RT-PCR法檢測各組大鼠成骨細胞Nampt mRNA表達水平分別于照射后8、16、32和64 h時間點收集成骨細胞于10 mL EP管中，Trizol法提取細胞總RNA。取2 μg RNA進行RT-PCR法檢測。根據GenBank中大鼠Nampt全基因序列(基因登錄號：NM-177928)設計引物。Nampt：上游引物為5′-GGCTACGTGGACGAC-

GACAC-3′，下游引物為5′-TCTGGTCCGGACGTCCCCTAC-3′，擴增片段大小為640 bp。內參β-actin：上游引物為5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′，下游引物為5′-GTTCTAGTAACGAGGAGGACT-3′，擴增片段大小為302 bp。PCR 擴增循環：94℃、30 s，54℃、60 s 和72℃、60 s；35個循環后72℃、5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA green結合后于紫外燈下觀察。UVP BioChemi System 熒光凝膠成像系統拍照，用Quantity One 4.6.2 軟件檢測條帶，各樣本RNA表達水平以吸光度(A)值表示,按照下列公式計算Nampt RNA表達水平并進行統計學分析。Nampt RNA表達水平=每個樣本條帶A值/β-actin A值。

2　結　果

2.1大鼠顱骨成骨細胞原代培養和鑒定組織塊法原代培養大鼠成骨細胞，培養2 d后于倒置顯微鏡下觀察可見：有細胞從組織邊緣爬出，細胞形態多樣，呈不規則形、三角形和梭形等，細胞有長短不一的突起且相互連接，胞質豐富，胞核清晰可見(圖1A，見插頁一)。待細胞長滿瓶底80%開始傳代，傳代后4～5 d進入指數生長期，呈集落樣生長趨勢，匯合處呈鋪路石狀。細胞呈復層式生長，密集處細胞形態不明顯，分界模糊。取第3代細胞培養20 d后，鏡下見細胞形成集落，聚集成不透光的礦化結節(圖1B，見插頁一)。不透明結節行茜素紅染色,呈橙紅色著色(圖1C，見插頁一)。

2.2各組大鼠顱骨成骨細胞形態及數目倒置顯微鏡下觀察可見：苯腎上腺素組細胞形態、數量與空白對照組比較未見明顯改變；單純照射組細胞形態發生皺縮，尤以照射8 h后明顯，細胞數量在照射8、16、32和64 h后分別是對照組的0.82、0.37、0.24和0.21倍；苯腎上腺素+照射組在照射8和16 h后細胞皺縮，較單純照射組輕微，且于照射32和64 h后細胞形態恢復(圖2，見插頁一)，在照射8、16、32和64 h后的細胞數量分別為空白對照組的0.91、0.83、0.72和0.75倍，是單純照射組的1.09、2.24、3.00和3.60倍。

2.3各組大鼠顱骨成骨細胞Nampt基因的表達在照射8、16、32和64 h后，單純照射組Nampt mRNA表達水平均較空白對照組減少(P<0.01)；苯腎上腺素+照射組Nampt mRNA表達水平較對照組減少(P<0.01)，但均較單純照射組增加(P<0.01)。見圖3和表1。

Lane 1:Control group; Lane 2:Phenylephrine group; Lane 3:Simple irradiation group; Lane 4:Phenylephrine+irradiation group.

圖3各組大鼠成骨細胞中Nampt mRNA 表達電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Nampt mRNA in osteoblasts of rats in various groups

3　討　論

在頭頸惡性腫瘤中應用放射治療可產生放射性骨壞死和病理性骨折等嚴重的并發癥，這些延遲的放射性損傷造成的創口遷延不愈，給患者帶來極大的痛苦[1-2,10]。尋找行之有效的預防放射性頜骨損傷的藥物靶點具有重要的理論及臨床意義。

苯腎上腺素是α1-AR特異性激動劑，作為血管活性藥物為臨床常用，用于升高血壓、減慢心率及抗休克等治療。越來越多的研究[5-6,11]顯示：苯腎上腺素對涎腺輻射損傷具有保護作用。本課題組前期研究[5-6,12]亦發現：苯腎上腺素可以促進早期放射損傷大鼠頜下腺細胞增殖，并抑制頜下腺細胞凋亡。Vasin等[13]的研究發現：苯腎上腺素在放療中對皮膚具有保護作用；Fahl[14]發現：放射前局部應用苯腎上腺素可以防止口腔黏膜炎的發生，并且不影響X射線對癌細胞的殺傷效果。苯腎上腺素是否對放射損傷的成骨細胞具有保護作用及其相關機制尚無文獻報道。本實驗采用新生大鼠的顱骨分離成骨細胞，培養的細胞具有典型的成骨細胞的形態學特征。8 Gy X射線照射大鼠成骨細胞后，單純照射組細胞發生明顯皺縮，且成骨細胞數目明顯減少；而苯腎上腺素+照射組成骨細胞皺縮減輕，在照射32 h后形態恢復正常，數目也較單純照射組細胞數目明顯增多。本實驗首次發現苯腎上腺素可減輕大鼠成骨細胞的放射性損傷。

表1　大鼠成骨細胞照射后不同時間點RNA灰度值

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with simple irradiation group.

電離輻射一方面直接作用于DNA、蛋白質及酶類物質破壞細胞結構，另一方面作用于組織中的水分子，使其電離產生自由基，間接致細胞變性、壞死。Nampt具有煙酰胺磷酸核糖轉移酶活性，與前B細胞克隆增強因子或內臟脂肪素的cDNA基因序列相同；在許多組織細胞的生理及病理過程中起到重要的調節作用，作為具有免疫調節功能的炎癥細胞因子參與急慢性炎癥反應，也起到NAD+合成中限速酶的作用。NAD作為一種輔酶調節眾多的酶活性，以控制一系列的生理過程。Revollo 等[15]發現：在哺乳動物細胞中Nampt過表達可使NAD 水平提高55%。研究者[9,16]認為：Nampt通過增加細胞NAD+水平,進而提高SIRT1活性，促進細胞存活。

綜上所述，Nampt促細胞存活的作用已得到越來越廣泛的關注。本實驗RT-PCR結果從基因水平證實放射損傷可使大鼠成骨細胞Nampt mRNA表達水平下調，而苯腎上腺素能夠上調Nampt mRNA表達水平。苯腎上腺素對放射損傷成骨細胞的保護作用機制可能與增加成骨細胞中Nampt mRNA表達水平有關。然而，苯腎上腺素上調成骨細胞Nampt mRNA表達水平的相關受體后信號轉導途徑尚待進一步研究。

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Protective effect of phenylephrine on irradiated injury of osteoblasts in rats

HAN Lichi1,WANG Xuehong1,DONG Hui2,WANG Yifei1,ZHANG Fuyin3,XIANG Bin1

(1. Department of Oral Medicine,College of Medical Sciences,Dalian University,Dalian 116622,China;2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery,First Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116011,China;3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Second Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116023,China)

ObjectiveTo investigate the effect of phenylephrine on the morphology and the expression level of Nampt mRNA in the irradiated osteoblasts of the rats,and to clarify the possible protective effects of phenylephrine on this injury.MethodsThe osteoblasts cultured by conventional tissue were randomly divided into control group, phenylephrine group,simple irradiation group,and phenylephrine+irradiation group.The cells in phenylephrine group were treated with 100 mmol·L-1phenylephrine 30 min before irradiation.The cells in simple irradiation group were irradiated with 8 Gy X-ray.The osteoblasts were observed by microscope and were collected at the time points of 8,16,32 and 64 h after irradiation.The Nampt mRNA expression level in osteoblasts was examined by RT-PCR.ResultsThere was no obviously morphological and number changes of osteoblasts in phenylephrine group compared with control group.The osteoblasts in simple irradiation group were atrophied,especially at 8 h; the number of osteoblasts in simple irradiation group was 0.82,0.37,0.24 and 0.21 times as control group respectively at 8,16,32 and 64 h. Atrophy of osteoblasts was alleviated in phenylephrine+irradiation group; at 8,16,32 and 64 h,the number of osteoblasts was 0.91,0.83,0.72 and 0.75 times as control group,and was 1.09,2.24,3.00 and 3.60 times as simple irradiation group.The expression level of Nampt mRNA in the osteoblasts in simple irradiation group was reduced compared with control group(P<0.01)at 8,16,32 and 64 h. There were significant differernces of the expression levels of Nampt mRNA in the osteoblasts between phenylephrine+irradiation group and control group(P<0.01),and there were significant differernces between phenylephrine+irradiation group and simple irradiation group(P<0.01)at the different time points.ConclusionPhenylephrine could reduce the atrophy of osteoblasts in the rats induced by irradiation and up-regulate the expression level of Nampt mRNA.Its protective effect on irradiated injury may be related to the up-regulation of the expression level of Nampt mRNA.

osteoblast; irradiation; phenylephrine;nicotinamide phosphoribosyltransferase

1671-587Ⅹ(2015)06-1113-05

10.13481/j.1671-587x.20150603

2015-04-13

國家自然科學基金資助課題(81170978，81371161)；遼寧省科技廳自然科學基金資助課題(201202008)；大連大學本科生創新教育基金項目資助課題(2013112)

韓立赤(1970-)，女，遼寧省臺安縣人，副主任醫師，醫學博士，主要從事口腔正畸基礎及臨床方面的研究。

韓立赤，副主任醫師，碩士研究生導師(Tel: 0411-87412315, E-mail: hanlichi@dlu.edu.cn);

向彬，教授，碩士研究生導師(Tel: 0411-87402916, E-mail: xiangbin@dlu.edu.cn)

R881.7

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