FPIA與CMIA測定環孢素A血藥濃度的相關性

賈 暖，董玉波

環孢素A（CsA）自1972年發現以來，被廣泛地應用于器官移植術后的免疫排斥反應。由于CsA服用后個體差異大，患者術后需長期服用，治療窗范圍窄，低于有效濃度易引起排斥反應或誘發自身免疫性疾病，高于有效濃度則易引起感染或肝／腎及中樞神經系統損害，所以有必要對用藥患者進行血藥濃度監測，CsA全血的濃度測定已經成為臨床醫師監測或調整給藥劑量的依據和常規。但是影響CsA血藥濃度結果的因素有很多[1]，其中檢測方法的不同，也會影響到臨床醫師對監測結果評判，以致影響用藥方案的調整。目前，臨床對CsA的檢測方法多為熒光免疫偏振法（FPIA），因其具備自動化程度高，樣品需求量少、重現性好、檢測速度快等優點，但此測定方法存在代謝物交叉反應，為了減少交叉反應對最終結果的影響，檢測方法從FPIA發展到化學發光微粒子分析法 （CMIA）。本文對 FPIA的 AxSYM與 CMIA的Architect I1000中測定結果的相關性進行研究，為臨床合理應用環孢素A提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光偏振免疫儀AxSYM （美國雅培公司）；化學發光微粒子分析儀Architect I1000（美國雅培公司）；Heraeus臺式離心機（德國 Heraeus）；XW－80A 旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）。試劑為Architect環孢霉素全血試劑盒、單克隆抗體全血環孢霉素試劑盒，及兩種儀器原配質量控制試劑盒、校準曲線試劑盒，以上試劑均為美國雅培（Abbott）制藥有限公司提供的標準試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 腎移植術后2周至12年患者124例。男95例，女29例；年齡19～64歲，平均38.9歲。服用環孢素A作為免疫抑制藥，于下次服藥前30 min抽取空腹靜脈血2～3ml，EDTA抗凝后進行全血CsA谷濃度檢測。

1.2.2 實驗室條件及血藥濃度測定 CsA全血濃度測定在室溫25℃標準化實驗室中進行，每一例患者樣本在同一天分別用AxSYM和Architect I1000兩臺儀器測定，測定方法按照美國Abbott公司提供的AxSYM全自動免疫生化分析儀和Architect I1000分析儀操作手冊操作。①熒光偏振免疫法：樣本取全血 150μl置1.5m l離心管中，加入 AxSYM標配50μl細胞溶解劑和300μl蛋白沉淀劑，渦旋混勻30 s，10000 r／min離心5min，取上清進行檢測。②化學發光微粒子法：樣本取全血200μl置1.5ml離心管中，加入 Architect I1000標配100μl細胞溶解劑和400μl蛋白沉淀劑，渦旋混勻30 s，10000 r／min離心4min，取上清液進行檢測。

1.2.3 校準曲線及最低檢測濃度 AxSYM標配校準曲線試劑盒濃度分別為 0、40、100、200、400、800 ng／ml CsA 的標準品溶液，按1.2.2項下操作進行校準，最低檢測濃度為23.2 ng／m l；取Architect I1000標配校準曲線試劑盒濃度分別為0、40、150、400、800、1500 ng／mlCsA 的標準品溶液，按 2.2 項下操作進行校準，最低檢測濃度為 25.0 ng／ml。

1.2.4 質量控制 AxSYM 標配低、中、高（70、300、600 ng／m l）3種不同濃度質量控制 （QC）樣品，按2.2項下操作；Architect I1000 標配低、中、高（81.3、150、761 ng／ml）3 種不同濃度質量控制（QC）樣品，按1.2.2項下操作。兩種儀器分別于同一天內分別處理并測定5份，評價日內精密度；同一樣品連續測定5 d，每天測定一份，評價日間精密度。

1.2.5 統計學方法 數據及結果以均數±標準差（x±s）表示，對兩種方法的檢測結果間進行相關分析，以r表示。兩種方法結果的比較采用配對t檢驗，P＜0.05則認為結果具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 質控樣品的分析測定 質控樣品的分析測定結果見表1。

表 1 兩種方法的 QC及 CV 結果（ng／m l，n＝5）

2.2 相關性分析 經兩種儀器對124例患者CsA全血樣本進行測試，將測試樣品以CMIA法測定結果（X）為橫坐標，FPIA法測定結果（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝1.241x＋8.8438，r＝0.9502（n＝124），曲線見圖 1。 CMIA 法測定濃度范圍 24.1～554.0 ng／m l，FPIA 法測定濃度范圍 57.7～769.1 ng／ml，CMIA 法比 FPIA 法平均偏差低 35.69 ng／ml。 將兩種方法的測定結果進行配對t檢驗，P＜0.05提示結果具有顯著性差異。

圖 1 兩種方法相關性分析

3 討 論

目前臨床上對CsA的測定HPLC和FPIA法較為成熟，而且兩種方法對檢測結果的比較也多受關注[2]，由于HPLC測定周期長，批量檢測時，FPIA法在臨床應用中已成為測定的首選方法[3]。但是這種技術也存在一定的局限性，被測藥物的多種內源性代謝物因為與其具有非常相似結構，易發生交叉反應而影響結果的準確性。CMIA與FPIA測定原理不同：FPIA法是根據抗原、抗體競爭結合法的原理，即利用被測物質中被測對象所有的偏振光性進行熒光免疫分析。CMIA采用兩步雙抗原夾心法，以順磁性微珠包被CsA抗體后，與標本中的CsA抗原結合，加入吖啶酯標記的CsA抗原后，在特定的磁場區發生沉積，經反復洗滌使游離抗原或抗體與抗原抗體復合物分離，測定其激發光強度的方法。受測定原理的影響，同一份樣品的結果也產生了偏倚，本試驗研究中同一CsA全血樣品分別采用兩種方法測定，ARCHITECT測定結果較AxSYM測定結果低，平均濃度低35.69 ng／m l，也有文獻報道 ARCHITECT 測定結果較 AxSYM平均濃度低 42.6 ng／ml[4]、76.5 ng／ml[5]，可能與所測樣品的濃度范圍以及樣本量、群體樣本的來源等因素有關。CsA口服吸收后，經CYP3A4代謝后產生30多種代謝產物（AM1、AM9、AM1c、AM4n、AM19 等）[6]， 而在達穩態后 AM1 能夠占母藥的40%[7]，CMIA法能夠減少代謝產物的交叉反應，尤其減少與AM1、AM9的交叉反應[8]，說明CMIA法相比FPIA法特異性較高，兩組數據之間的差異具有統計學意義。CMIA法的測定值更能夠反應母藥在體內的濃度，結果更準確。兩方法相關系數為0.9502，表明兩測量結果具有高度相關，與文獻[9，10]報道一致。 另 CMIA 法的線性范圍 0～1500 ng／m l，而FPIA法的線性范圍0～800 ng／m l，若在臨床上需要監測服藥后 2 h的血藥濃度 （C2） 或待測標本濃度超過 800 ng／m l，CMIA方法可以減少需要稀釋而帶來的誤差。

CMIA法比FPIA法特異性和靈敏度高，CMIA法優于FPIA法。患者在進行環孢素血藥濃度檢測時，盡量選擇同一醫院同一種儀器進行測定，檢測報告最好注明檢測方法，以方便臨床醫師結合患者的個體情況給出準確的藥物調整方案。

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