發酵劑用量對硬質蒙古干酪蛋白質、脂類水解和微觀結構的影響

高　鑫，張　亮，李　博（.上海工會管理職業學院 健康安全系，上海 045；.上海交通大學 醫學院，上海 0040）

發酵劑用量對硬質蒙古干酪蛋白質、脂類水解和微觀結構的影響

高鑫1，張亮2，李博1
（1.上海工會管理職業學院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大學 醫學院，上海 200240）

該文通過添加不同發酵劑用量制作了3種硬質蒙古干酪，并對硬質蒙古干酪的理化性質、蛋白質和脂肪水解程度、微觀結構等進行了研究。結果表明，隨著發酵劑用量增多，除D-乳酸含量外，其他理化指標均隨發酵劑用量的增大而減小；粗蛋白質和粗脂肪的含量減少；pH 4.6-可溶性氮（SN）含量和12%三氯乙酸（TCA）-SN含量均增加，表明干酪中蛋白質和脂肪的水解程度增大；游離氨基酸和游離脂肪酸的含量增加，表明干酪的風味物質增多。隨著發酵劑用量的增多，干酪酸化速度加快，質地相對松散。最終確定發酵劑使用量為1.0 g/L，在此條件下，脂肪和蛋白質的水解程度適中，游離氨基酸種類豐富，能夠滿足干酪風味化合物生成的需求。

硬質蒙古干酪；蛋白質水解；脂肪水解；微觀結構

內蒙古草原以畜牧業為主，是傳統奶制品的發源地之一，干酪是奶制品中最普遍的食品，為蒙古族人所喜愛［1］。干酪是在乳中加入適量發酵劑和凝乳酶，排除乳清而得到的濃縮聚合物，營養豐富，有“奶黃金”之稱［2］。聯合國糧農組織（food and agricu1ture organization，FAO）和世界衛生組織（wor1d hea1th organization，WHO）制定的有關于干酪的國際通用定義為：以牛乳、奶油、部分脫脂乳、酪乳或這些產品的混合物為原料，經凝乳并分離乳清而制得的新鮮或發酵成熟的乳制品［3］。

蒙古族干酪（簡稱“蒙古干酪”）是以羊奶或牛奶為原料制作而成，在傳統乳制品中獨樹一幟，倍受國內外游客的青睞。目前蒙族牧民傳統干酪的生產中沒有固定的菌種，采用自然發酵。在制作工藝上采用家庭式手工生產，制作工藝簡單，操作條件不嚴格，導致蒙古干酪產品性能不穩定、口味不一［4］。隨著蒙古干酪的流行，手工制作方式難以滿足需求。因此，蒙古干酪的工業化生產迫在眉睫。干酪發酵劑通常分為細菌發酵劑和霉菌發酵劑兩大類。細菌發酵劑主要以乳酸菌為主，包括乳酸鏈球菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌等。霉菌發酵劑主要使用的是對脂肪分解能力強的卡門培爾干酪霉菌、干酪青霉、婁地青霉等［5-6］。本實驗以嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為發酵劑，探討了蒙古干酪制作過程中發酵劑用量對干酪理化性質、蛋白質和脂肪水解及干酪微觀結構的影響，確定合適的發酵劑使用量，為進一步工業化生產蒙古干酪提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophi1es）和保加利亞乳桿菌（Lactobaci11us bu1garicus）：北京川秀國際貿易有限公司；原料乳：光明乳業上海金山牧場，并對牛乳進行標準化；凝乳酶（酶活力5 100～5 900 IMCU/g）：法國丹尼斯克公司；D/L-乳酸檢測試劑盒、乙醇檢測試劑盒：德國拜發R-Biopharm公司；氯化鈉、無水乙醇、無水乙醚、氨水、石油醚（沸程30～60℃）、濃硫酸（98%）、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、乙酸、乙酸鈉、三氯乙酸（trich1oroacetic acid，TCA）、戊二醛（25%）均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸標準液（0.1 mo1/L）、氫氧化鉀標準液（0.1 mo1/L）：上海化工研究院。

1.2儀器與設備

FE20 pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；MIR-154恒溫培養箱：三洋電機貿易株式會社；GL-20實驗型干酪生產設備：上海順儀實驗設備有限公司；SX2數控馬弗爐：上海雷韻試驗儀器制造有限公司；FOSS K2300凱氏定氮儀：瑞典福斯公司；Sirion 2000高分辨場發射掃描電子顯微鏡：美國FEI公司；Biopharm乳酸檢測分析試劑盒、Biopharm乙醇檢測分析試劑盒：德國拜發公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1硬質蒙古干酪的制作工藝流程［7］

原料乳→驗收、標準化→滅菌→冷卻→添加發酵劑→加凝乳酶→凝乳切割→凝塊中加鹽→裝模成型、壓膜→成熟

操作要點：將驗收、標準化的原料乳進行巴氏滅菌（63℃、30 min）后冷卻至30℃，加入發酵劑（嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌（2∶1）），當pH降低0.1時，添加凝乳酶（0.03 g/L原料乳），32℃凝乳40 min，將凝乳切塊成1 cm左右的凝塊，排除乳清后在凝乳粒中加鹽，加鹽量為30 g/kg凝塊，加鹽后的干酪裝入模具中擠壓成型，放入8℃、相對濕度（re1ative humidity，RH）85%的恒溫恒濕箱內成熟21 d。根據發酵劑用量的不同，記為干酪A（0.5 g/L原料乳）、干酪B（1.0 g/L原料乳）和干酪C（1.5 g/L原料乳），對成熟的干酪取樣進行各項指標檢測。

1.3.2干酪理化性質測定

干酪水分含量測定：依照GB/T 5009.3—2003《食品中水分含量的測定》中的方法。干酪灰分含量測定：依照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》中的方法。干酪pH值測定：直接使用干酪pH計測定干酪pH值。乳酸含量測定：D-乳酸和L-乳酸含量的測定：使用Biopharm乳酸檢測分析試劑盒測定，操作步驟按照使用說明書進行。乙醇含量測定：使用Biopharm乙醇檢測分析試劑盒測定，操作步驟按照使用說明書進行。

1.3.3干酪蛋白質水解程度檢測

（1）干酪粗蛋白含量測定

總氮含量的測定采用凱氏定氮法。蛋白質含量測定依照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的方法，計算公式如下：

蛋白質含量=總氮含量（%）×6.38

式中：6.38為干酪蛋白質換算系數。

（2）可溶性氮及游離氨基酸含量的測定

pH 4.6-可溶性氮（so1ub1e nitrogen，SN）含量的測定采用MEI J等［8］的方法，準確稱取0.750 0 g干酪于離心管中，然后加入30 mL pH 4.6的乙酸鹽緩沖溶液，溶解后，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，通過減重法取10 mL上清液，將其移入凱氏消化瓶中，測定其氮含量，pH 4.6-SN含量計算公式如下：

式中：X1為上清液中氮含量，%；m為干酪的質量，g；m1為離心后上清液的質量，g；m2為采用減重法后10 mL上清液的質量，g。

12%TCA-SN含量測定采用MEI J等［8］的方法：準確稱取1.5000g干酪于離心管中，然后加入30 mL12%的TCA溶液，溶解后，4 000 r/min轉速離心20 min，取上清液，通過減重法取10 mL上清液，將其移入凱氏消化瓶中，測定其含氮量，12%TCA-SN含量計算公式如下：

式中：X2為上清液中氮含量，%；m為干酪的質量，g；m1為離心后上清液的質量，g；m2為采用減重法后10 mL上清液的質量，g。

游離氨基酸含量測定采用MEI J等［8］的方法：稱取1.000 g干酪，用超純水溶解后定容至5 mL，以4 000 r/min離心30 min，取1 mL上清液，加入2倍體積10%的TCA溶液，充分混勻，-20℃冷凍靜置15 min；4℃、轉速10 000 r/min離心15 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾樣品，調整樣品pH值為2.0。通過全自動氨基酸分析儀，采用茚三酮柱后衍生法對干酪中游離氨基酸含量進行檢測。

1.3.4干酪脂肪水解程度檢測

干酪粗脂肪含量測定：采用羅茲哥特里法［9］。干酪游離脂肪酸含量測定根據國標GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》中的方法進行測定，結果以油酸計。

1.3.5干酪微觀結構的測定

取一小塊干酪（5 mm×5 mm×5 mm）于2.5%戊二醛溶液中，4℃放置4 h進行固定，然后用0.2 mo1/L磷酸緩沖液清洗2～3次，每次15 min，再分別用體積分數15%、30%、50%、70%乙醇溶液各脫水10 min，體積分數85%及95%乙醇溶液各脫水15 min，再用無水乙醇脫水1 h，將樣品放入液氮中進行臨界點干燥，用離子覆膜機鍍金后掃描電鏡觀察并拍照。

2　結果與分析

2.1干酪理化性質的檢測

3種硬質蒙古干酪理化性質的檢測結果見表1。

表1　硬質蒙古干酪的理化性質Table 1 Physicochemical properties of hard Mongolian cheese

由表1可知，除D-乳酸含量外，其他理化指標均隨發酵劑用量的增大而減小，3種硬質蒙古干酪水分含量在42.94%～44.92%之間，符合硬質干酪的水分含量要求［10］。乳酸對干酪風味的形成有很大的作用，干酪中殘余的乳糖在干酪成熟過程中會逐漸被乳酸菌分解為乳酸，同時，乳酸也會進一步反應生成乙酸，導致乳酸含量減少。發酵劑用量越大，L-乳酸的含量減少，可能與其轉化為其他代謝產物有關，從保健角度看，過量食用D-乳酸會導致尿中出現高酸度現象，引起代謝紊亂，所以世界衛生組織限制人體每天攝入D-乳酸量在100 mg/kg體質量以下。在干酪中D-乳酸含量與L-乳酸含量變化之間在統計學上沒有必然關系，可能是由于干酪在成熟過程中發生了消旋作用，DEIANA P等［11］在研究由乳酸菌和酵母菌組成的混合發酵劑制作Pecorino Romano干酪過程中乳酸和乙酸的代謝時，也發現了這種情況。干酪中很多代謝途徑都與乙醇的合成有關，一般來說，乙醇主要通過下列生化途徑生成：乳糖代謝、甲基酮降解、氨基酸代謝和亞油酸、亞麻酸的降解產生［12］。乙醇和干酪中的脂肪酸會發生反應，產生乙酯類化合物，是干酪重要的揮發性風味化合物，發酵劑使用量越大，乙醇含量越小，說明乙醇參與代謝的程度越大，發酵劑微生物越活躍。在3種干酪的制作過程中，由于干酪C發酵劑用量大，酸化原料乳速度相對較快，縮短了干酪的制作時間。但會導致凝乳收縮過度，乳清過量析出，質地相對松散，而干酪A和干酪B質地比較緊密，韌性較好。高發酵劑使用量會導致較低的pH值，使得酪蛋白持水性降低，對干酪的硬度造成影響。

2.2干酪中蛋白質和脂類水解程度

在干酪的制作過程中，大部分的凝乳酶隨入乳清排出，而在之后的儲藏過程中干酪中的蛋白質水解，主要是由殘存在干酪中的少量凝乳酶造成的［13］。干酪中殘存的凝乳酶繼續作用于酪蛋白形成肽類，進一步被降解形成小肽及氨基酸。蛋白質降解后，可溶性組分增加，因此，干酪浸出物中氮組分的數量和種類常作為干酪成熟過程中蛋白質降解的標志。干酪中蛋白質和脂類水解程度變化結果見表2。

表2　硬質蒙古干酪中蛋白質和脂肪的水解程度Table 2 Hydrolysis degree of protein and fat in the hard Mongolian cheese %

由表2可知，隨發酵劑用量增多，干酪中蛋白質含量減少，可溶性氮含量增多，可能是由于干酪發酵劑用量多，微生物分泌的蛋白質水解酶總量也較多，蛋白質水解的速度相對也快。一般認為pH 4.6-SN表示了蛋白質水解的廣度，它主要分離出的是小肽和中肽［14］。在干酪成熟過程中，粗蛋白質減少越多，pH 4.6-SN增加也就越多。同時，pH 4.6-SN受到發酵劑使用量的影響，發酵劑使用量越多pH 4.6-SN增加的也就越快。而12%TCA-SN是干酪成熟的指標之一，它反映了干酪中蛋白質水解的深度。12%TCA-SN中主要成分是小分子肽和游離氨基酸，由凝乳酶和發酵劑產生的肽酶共同作用而產生的［15］。12%TCA-SN含量受到發酵劑用量的影響，用量越多，12%TCA-SN的生成量越大。蛋白質水解速度前期較快，中后期緩慢，發酵劑使用量多，蛋白質水解的速度也快。所以整體上來說，蛋白質水解速度順序是干酪C＞干酪B＞干酪A。在干酪成熟期間，pH 4.6-SN一直呈現增加趨勢，一般來講，粗蛋白質減少越多，pH 4.6-SN增加也就越多。

干酪成熟過程發生的脂肪水解對干酪的風味和感官影響至關重要，水解產生的游離脂肪酸會直接影響干酪的風味，同時游離脂肪酸可以通過酶促反應或化學反應產生風味物質。由表2可知，發酵劑用量增加，干酪A、B、C中粗脂肪含量減少，游離脂肪酸含量有所增長，說明脂肪水解程度越大。

游離氨基酸可以給干酪提供風味支持，本身可呈現出一定的滋氣味，同時也是大量風味物質的前體［16］。干酪中游離氨基酸種類和含量的檢測結果見表3。由表3可知，干酪A和C檢測出16種氨基酸，干酪B檢測出15種氨基酸。干酪C中游離氨基酸總含量最高，由于發酵劑使用量越大，分解蛋白質能力越強，產生的游離氨基酸量也會明顯增加。在檢測的所有16種氨基酸中，谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、脯氨酸等7種氨基酸含量較高，約占了游離氨基酸總含量的80%左右。其中，谷氨酸含量最高，主要呈現酸味。蘇氨酸、絲氨酸和甘氨酸可以為硬質蒙古干酪提供一定的甜味。游離氨基酸中的天門冬氨酸、谷氨酸的出現使得干酪的酸味會明顯加強，亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸的增加使得干酪存在一定苦味，由于干酪加工過程中產酸使得干酪后期的酸味、苦味會加強，其程度隨著發酵劑用量的增加而增加。

表3　硬質蒙古干酪中游離氨基酸的種類和含量Table 3 Species and contents of free amino acids in the hard Mongolian cheese mg/kg干酪

2.3干酪的微觀結構

干酪的微觀結構主要是蛋白質相形成的復雜排列組合，硬質蒙古干酪是一種酶凝干酪，其形成的蛋白纖維結構較薄［17］。3種干酪在掃描電子顯微鏡微觀結構見圖1。發酵劑使用量越多，酪蛋白水解程度越大，由酪蛋白構成的連續結構逐漸水解為短鏈結構，酪蛋白矩陣結構鈍化，并開始出現新的空穴，表現為干酪結構多孔而致密。所以，干酪A的微觀結構表現為團狀，而干酪C表現為多空，干酪B的微觀結構在兩者的過渡態。微觀結構圖1A、1B、1C可見明顯的孔狀結構，孔狀結構主要是在樣品前處理過程中脫水脫脂所形成。在干酪中，聚集的脂肪球會鑲嵌在酪蛋白膠束形成的網狀結構中，限制了脂肪球基粒的收縮，控制了孔狀結構的大小分布。孔狀結構有利于游離脂肪、水以及其他物質（礦物質、小肽和各種酶）的儲藏，這樣的脂肪球組成的脂肪相和干酪蛋白的蛋白相間具有一定的流動性。同時可以看見明顯的由副酪蛋白磷酸鈣和酪蛋白顆粒形成的基粒，這樣的基粒構成了一個連續性較強的長鏈狀聚集物，由于聚集基粒的分子間疏水作用和靜電引力而形成了大體的交聯結構。

圖1　三種硬質蒙古干酪掃描電子顯微鏡微觀結構Fig.1 The microstructure of three kinds of hard Mongolian cheese by scanning electron microscope

3　結論

本實驗通過添加不同質量濃度的發酵劑制作了3種硬質蒙古干酪，對比了3種干酪的理化指標、蛋白質和脂肪的水解程度、微觀結構。結果表明，隨著發酵劑用量增多，除D-乳酸含量外，其他理化指標均隨發酵劑用量的增大而減小；粗蛋白質和粗脂肪的含量減少，pH 4.6-SN含量和12%TCA-SN含量增加，表明干酪中蛋白質和脂肪的水解程度增大；游離氨基酸和游離脂肪酸的含量增加，表明干酪的風味物質增多。干酪C酸化速度較快，質地相對松散，干酪A發酵凝乳時間較長，較難排出乳清，而干酪B在酸化原料乳達到合適凝乳pH值和凝乳狀態的判斷中均具有優勢，且干酪B含水量適中，硬度適中。在此條件下，脂肪和蛋白質的水解程度合適，游離氨基酸較為豐富，能夠滿足干酪風味化合物生成的需求。因此，確定發酵劑使用量為1.0 g/L原料乳，在此條件下所制得的干酪具有良好的蛋白質和脂肪水解能力。

［1］焦晶凱，莫蓓紅.I11umina MiSeq平臺高覆蓋率測定干酪中的細菌微生物多樣性［J］.中國釀造，2014，33（5）：34-38.

［2］楊威，徐瑤，張東京，等.小型硬質干酪加工工藝的研究［J］.食品工業，2014（3）：51-55.

［3］宋曉敏，李少英，馬春艷，等.內蒙古牧區乳酸球菌的分離鑒定及耐藥表型分析［J］.中國釀造，2014，33（5）：44-48.

［4］楊永龍，張杰，宗學醒，等.蒙古干酪生產工藝研究［J］.中國乳品工業，2009（9）：46-49.

［5］HICKEY C D，AUTY M A E，WILKINSON M G，et a1.The inf1uence of cheese manufacture parameters on cheese microstructure，microbia1 1oca1isation and their interactions during ripening:A review［J］.Trends Food Sci Tech，2015，41（2）:135-148.

［6］KARIMI R，MORTAZAVIAN A M，DA CRUZ A G.Viabi1ity of probiotic microorganisms in cheese during production and storage:a review ［J］.Dairy Sci Tech，2011，91（3）:283-308.

［7］MEI J，FENG F，GUO Q，et a1.Eva1uation of freeze-dried Tibetan kefir co-cu1ture as a starter for production of Bod 1jong cheese［J］.Food Sci Biotechnol，2015，24（3）:1017-1027.

［8］MEI J，GUO Q，WU Y，et a1.Study of proteo1ysis，1ipo1ysis，and vo1ati1e compounds of a camembert-type cheese manufactured using a freezedried Tibetan kefir co-cu1ture during ripening［J］.Food Sci Biotechnol，2015，24（2）:393-402.

［9］劉紹.食品分析與檢驗［M］.武漢：華中科技大學出版社，2011.

［10］郭本恒，劉振民.干酪科學與技術［M］.北京：中國輕工業出版社，2015. ［11］DEIANA P，FATICHENTI F，FARRIS G A，et a1.Metabo1ization of 1actic and acetic acids in pecorino romano cheese made with a combined starter of 1actic acid bacteria and yeast［J］.Dairy Sci Technol， 1984，64（640-642）:380-394.

［12］SHIOTA M，IWASAWA A，SUZUKI-IWASHIMA A，et a1.Effects of f1avor and texture on the sensory perception of gouda-type cheese varieties during ripening using mu1tivariate ana1ysis［J］.J Food Sci，2015，80（12）:C2740-C2750.

［13］FOX P.Proteo1ysis during cheese manufacture and ripening［J］.J Dairy Sci，1989，72（6）:1379-1400.

［14］DIEZHANDINO I，FERNáNDEZ D，GONZáLEZET L，et a1.Microbio1ogica1，physico-chemica1 and proteo1ytic changes in a Spanish b1ue cheese during ripening（Va1deón cheese）［J］.Food Chem，2015，168（1）: 134-141.

［15］ARENAS R，GONZáLEZ L，SACRISTáN N，et a1.Compositiona1 and biochemica1 changes in Genestoso cheese，a Spanish raw cow's mi1k variety，during ripening［J］.J Sci Food Agr，2015，95（4）:851-859.

［16］CALASSO M，MANCINI L，DI CAGNO R，et a1.Microbia1 ce11-free extracts as sources of enzyme activities to be used for enhancement f1avor deve1opment of ewe mi1k cheese［J］.J Dairy Sci，2015，98（9）:1-16.

［17］HICKEY C D，AUTY M A E，WILKINSON M G，et a1.The inf1uence of cheese manufacture parameters on cheese microstructure，microbia1 1oca1isation and their interactions during ripening:A review［J］.Trends Food Sci Tech，2015，41（2）:135-148.

Effect of starter addition on proteo1ysis，1ipo1ysis and microstructure of hard Mongo1ian cheese

GAO Xin1，ZHANG Liang2，LI Bo1（1.Department of Hea1th and Security，Shanghai Trade Union Po1ytechnic Co11ege，Shanghai 201415，China；
2.Schoo1 of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

The three hard Mongo1ia cheese were manufactured with different starter addition，and the physicochemica1 property，proteo1ysis，1ipo1ysis and microstructure of the cheeses were researched.Resu1ts indicated that aside from D-1actic acid content，other physicochemica1 indicators were decreased with increasing starter addition，and the content of crude protein and crude fat were decreased.However，the content of pH 4.6-SN and 12% TCA-SN was increased，which indicated that the hydro1ytic degree of protein and fat in the cheeses was increased.The content of free amino acid and free fatty acid was increased，which indicated that the f1avor compounds of chesses were increased.With the increasing of starter addition，acidification speed of cheese was speeded up，and the texture was re1ative1y 1oose.Fina11y，the starter addition was determined as 1.0 g/L.Under the condition，the hydro1ytic degree of protein and fat in the cheeses was moderate，kinds of free amino acid were abundant，which cou1d meet the generated need of cheese f1avor compounds.

hard Mongo1ian cheese；proteo1ysis；1ipo1ysis；microstructure

TS201.3

A

0254-5071（2015）12-0088-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.019

2015-08-20

上海市高校選拔培訓優秀青年教師科研專項基金資助項目（ghz09005）

高鑫（1982-），男，講師，碩士，主要從事乳品科學相關研究工作。