鮑魚臟器酶解工藝條件的優(yōu)化

郭　芳，方　婷，陳錦權（.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 35000）

鮑魚臟器酶解工藝條件的優(yōu)化

郭芳1，方婷2，陳錦權2
（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002）

以鮑魚內臟為原料，采用堿性蛋白酶水解鮑魚內臟制備血管緊張素轉換酶（ACE）抑制肽。在單因素試驗的基礎上，采用響應

面法和Box-Behnken試驗優(yōu)化酶解鮑魚內臟的工藝條件。以ACE抑制率為考察指標，探討了酶解溫度、加酶量和酶解時間對ACE抑制率的影響。試驗結果表明，最優(yōu)工藝條件為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時間5.5 h，此條件下獲得的鮑魚內臟酶解產物的ACE抑制率為79.72%。

鮑魚內臟；酶解；ACE抑制率；響應面法

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）對人體內血壓調節(jié)起關鍵作用［1］。降壓肽即ACE抑制肽，是一類ACE抑制劑。降壓肽通過抑制ACE的活性，抑制具有升高血壓作用的血管緊張素II的生成，同時阻礙能降低血壓的血管舒緩激肽的分解，從而使血壓降低［2］。其中，由食源性蛋白制備的降血壓肽因其無毒副作用、安全性高，且對血壓正常者不產生降壓效果［3］，適宜長期食用，已經成為當前研究的熱點。

有關資料顯示，已從大豆、牛奶、乳酪、魚類、藻類和貝類等食物的蛋白質酶解產物中分離出ACE抑制活性比較高的降血壓活性肽［4-17］；據(jù)有關研究發(fā)現(xiàn)，從魚、蝦、蟹等水產類動物蛋白中酶解制備的降壓肽，其降壓活性要優(yōu)于其他食源性蛋白［18］。但鮮見鮑魚內臟蛋白制備降血壓肽的報道。隨著鮑魚養(yǎng)殖業(yè)、加工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的鮑魚臟器被當作加工廢棄物而堆積起來，極容易變質腐爛，造成了相當大的經濟損失，同時也會帶來環(huán)境污染的問題。本實驗以鮑魚內臟為原料，利用在CUSHMAN D W等［19］體外測定方法基礎上的改進方法［13］，測定鮑魚臟器蛋白酶解產物的ACE抑制活性，擬為后續(xù)的分離純化鮑魚內臟降血壓肽提供理論基礎。本研究為鮑魚資源的綜合利用提供了依據(jù)，并為天然降血壓保健品的開發(fā)和研究提供試驗數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮑魚臟器：漳州歐圣食品有限公司；食用酒精：福州南港食品添加劑有限公司；A1ca1ase堿性內切蛋白酶：丹麥諾維信公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippury1-His-Leu hydrate，HHL）、血管緊張素轉化酶（ACE）：美國Sigma公司；馬尿酸標準品：中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

L-550大容量離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；HT-2A雙頭磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV6300PC紫外可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；R205旋轉蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司；MJ-60B01A攪拌機：廣東美的精品電器制造有限公司；SJ-3F pH計：上海精密科學儀器有限公司；高壓脈沖電場設備：食品工程試驗室自制。

1.3方法

1.3.1原料前處理

鮑魚內臟→去結締組織→加2倍質量的水打漿→過60目篩→膠體磨處理→高壓脈沖電場處理→離心（3 500 r/min、20 min）→去上清，取沉淀→加食用酒精（體積分數(shù)75%）攪拌2 h→離心（3 500 r/min、15 min）→去上清，取沉淀→酒精脫色處理重復2次→蛋白沉淀復溶并進行旋轉蒸發(fā)→脫去酒精→得到的蛋白液，凍藏備用。

1.3.2酶解試驗

將預處理液解凍，按1∶5（g∶mL）的比例加水調漿，根據(jù)要求調節(jié)勻漿的pH及反應溫度，按料液比1∶3（g∶mL）加入堿性蛋白酶進行酶解反應，完成后在100℃條件下加熱15 min滅酶，4 000 r/min離心15 min后收集上清液。

1.3.3ACE抑制活性的檢測

ACE抑制率：按照參考文獻［19］的方法計算。

1.3.4鮑魚臟器蛋白酶解單因素試驗

以ACE抑制率為評價指標，分別考察酶解溫度、pH值、加酶量及酶解時間等條件對鮑魚臟器蛋白酶解液降壓活性的影響。

1.3.5鮑魚臟器蛋白酶解響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用三元二次通用旋轉組合試驗設計與響應面分析法，探討酶解溫度（A）、酶解時間（B）、加酶量（C）及其交互作用對酶解液ACE抑制率的影響，并建立各因素與ACE抑制率間的數(shù)學模型。響應面試驗因素水平見表1。

表1響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1酶解溫度對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響

在pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%的條件下，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃酶解4h，考察酶解溫度對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，所得酶解液的ACE抑制活性隨著溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，酶解物ACE抑制率在30～50℃升高較快；在50℃時酶解物ACE抑制率達到峰值，為78.16%；在50～70℃下降緩慢，這是由于酶活受溫度的影響造成的［20］。所以選擇最適的酶解溫度為50℃。

圖1　酶解溫度對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

2.1.2pH對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響

在溫度為50℃，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%的條件下，分別控制水解液的pH值為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0酶解4 h，考察pH對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響，結果如圖2所示。

圖2　pH對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of pH on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

由圖2可知，在pH 8.0～10.0的范圍內，pH對酶解液ACE抑制率的影響不大。當pH在8.0～9.0的范圍內，ACE抑制率隨著pH的增大而增大；當pH為9.0時，ACE抑制率達到最大值，為75.95%；pH＞9.0時，ACE抑制率隨著pH的升高而降低。說明此條件下鮑魚臟器蛋白液酶解產物的降壓活性最高，所以選擇最適pH值為9.0。

2.1.3加酶量對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響

在酶解溫度50℃，料液比1∶3（g∶mL），pH 9.0，酶解時間4 h的條件下，分別控制加酶量為1%、3%、5%、7%、9%，考察加酶量對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，鮑魚臟器蛋白酶解液的ACE抑制率隨著酶添加量的增加而上升，提高速率開始時候比較大，當加酶量為5%時，ACE抑制率為75.93%；當加酶量＞5%時，ACE抑制率逐漸降低，最后曲線趨于平緩。綜合節(jié)約成本的考慮，加酶量選擇為5%比較合適。

圖3　加酶量對鮑魚臟器酶解產物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

2.1.4酶解時間對鮑魚臟器酶解產物ACE的影響

在酶解溫度50℃，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%，pH 9.0的條件下，將鮑魚臟器蛋白液進行水解，每隔1h取樣測定，考察時間對鮑魚臟器酶解產物ACE的影響，結果如圖4所示。

圖4　酶解時間對鮑魚臟器酶解產物ACE的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

由圖4可知，隨著反應時間延長，酶解產物的ACE抑制率呈先急速升高后又緩慢下降的趨勢，在酶解時間為5 h時，ACE抑制率達到峰值，為76.14%；酶解時間達到5 h后，ACE抑制率緩慢下降。這可能是在酶解反應初期，底物質量分數(shù)高，水解速率大，降壓活性短肽產生較快；隨著反應的進行，底物質量分數(shù)降低，酶解速率下降，同時部分的短肽片段進一步被水解，從而導致降壓活性下降；而且隨著時間的積累，蛋白酶發(fā)生變性也會對酶解反應造成極大的影響［21］。因此，酶解時間5 h為宜。

2.2響應面試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，選擇溫度（A）、時間（B）、加酶量（C）為3個因素，以ACE抑制率（Y）為響應值，進行響應面試驗，試驗結果與分析見表2，得到回歸模型參數(shù)的方差分析見表3。

表2　鮑魚臟器蛋白酶解響應面試驗結果與分析Table 2 Design and results of response surface experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從方差分析（表3）可以看出，F(xiàn)失擬=1.39，對應的P＞0.1，失擬效果不顯著，說明本模型擬合性好；F模型=5.67，對應的P＜0.05，說明本模型顯著。此模型中顯著項為B、A2、B2、C2。比較溫度、時間、加酶量3因素的F值可得出：在酶解試驗中，時間的影響最大，其次為加酶量，溫度的影響為最小。

使用Design-Expert 8.0軟件對試驗結果進行分析，建立溫度、時間、加酶量與ACE抑制率之間的數(shù)學回歸模型，得到編碼的回歸方程如下：

根據(jù)后歸分析結果作響應面及等高線圖，結果見圖5。圖中分別表示當酶解溫度、酶解時間、加酶量中任意一個變量取0水平時，其余兩個變量的交互作用對ACE抑制率的影響。從圖5可以看出，任意兩個因素間都存在較明顯的交互作用，最佳點在試驗考察的范圍內。

利用Design Expert-8.0軟件優(yōu)化組合工藝參數(shù)，得到酶解鮑魚臟器蛋白的最佳工藝條件為酶解溫度51.8℃、酶解pH 9.0、料液比1∶3（g∶mL）、加酶量4.46%、酶解時間5.53 h。為便于操作，修改試驗條件為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時間5.5 h，對優(yōu)化的結果重新進行試驗，測得的ACE抑制率實際值為79.72%，與預測值79.78%基本吻合，驗證了回歸方程的準確性，證明了該試驗設計及分析方法較為可靠。

3　結論

本試驗采用堿性蛋白酶水解鮑魚臟器蛋白制備ACE抑制肽，以ACE抑制率為評價指標，利用響應面法探討了最優(yōu)的酶解工藝，結果表明，制備ACE抑制肽的最佳工藝參數(shù)為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時間5.5 h。對優(yōu)化的結果進行驗證試驗，酶解液的ACE抑制率為79.72%。但只是得到了鮑魚臟器蛋白ACE抑制肽的初產物，后續(xù)的分離、純化及其結構鑒定還需進一步的進行研究。

［1］曹文紅，章超樺.食品蛋白降血壓肽及其酶法制備（二）［J］.食品科技，2002，27（5）：11-13.

［2］YAMAMOTO N.Antihypertensive peptide derived from food proteins ［J］.Biopolymers，1997，43（5）:129-134.

［3］肖紅，段玉峰，劉平，等.食品蛋白降血壓肽及其研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2004，25（5）：3-6.

［4］MEISEL H，GOEPFERT A，GUNTHER S.ACE inhibitory activifies in mi1k products［J］.Milchwissen schaft，1997，52（6）:307-311.

［5］HAILESELASSIE S S，LEE B H，GIBBS B F.Purification and identification of potentia11y bioactive peptides from enzyme-modified cheese［J］. J Dairy Sci，1999，82（8）:1612-1617.

［6］劉佳，王興國，楊嚴俊.酶法制備大豆蛋白降血壓肽的研究［J］.中國油脂，2008，33（9）：6-9.

［7］SEKI E，OSAJIMA K.Quantitative ana1ysis of digestion resistant ace inhibitory dipeptides by sma11 intestina1 mucosa［J］.Nippon Skokukin Kagaku Kagaku Kaishi，1996，43（8）:967-969.

［8］SHIN Z I，YU R，PARK S A，et a1.His-His-Leu，an angiotensinⅠconverting enzyme inhibitory peptide derived from orean soybean paste，exerts antihypertensive activityin vivo［J］.J Agr Food Chem，2001，49（6）: 3004-3009.

［9］管驍，劉靜，王立，等.高活性燕麥蛋白源ACE抑制肽的制備、純化及結構鑒定［J］.高等學?；瘜W學報，2009，30（10）：1992-1997.

［10］WANGXC，CHENP，LIANGSP.Liquid chromatography-tandem mass spectrometry ana1ysis of a synthestic nonapeptide and its main by-products［J］.Chinese J Biochem Mol Biol，2003，19（5）:576-581.

［11］黃佳音，朱宇潔，沈金玉.玉米蛋白制備降血壓肽的研究［J］.食品科學，2007，28（12）：290-293.

［12］黃艷春，劉張虎，熊善柏.酶解鰱肉制取ACE抑制肽工藝條件的優(yōu)化［J］.食品科學，2007，28（2）：181-184.

［13］王茵，劉淑集，吳成業(yè).紫菜降血壓肽酶法制備工藝的優(yōu)化［J］.福建水產，2008（4）：64-68.

［14］MARUYAMA S，MITACH H，TANAKA H，et a1.Studies on the active site and antihypertensive activity of angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitors derived from casein［J］.Agric Biol Chem，1987（51）:1581-1586.

［15］SUETSUNA K，CHEN J R.Identification of antihypertensive peptides from peptic digest of two microa1gae，Ch1ore11a vu1garisandSpiru1ina p1atensis［J］.Mar Biotechnol，2001，3（4）:305-314.

［16］FUJITA H，YOSHIKAWA M.A prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein［J］.Immunopharmacology，1999，44（1/2）: 123-127.

［17］FAHMI A，MORIMURA S，GUO H，et a1.Production of angiotensinⅠconverting enzyme inhibitorypeptides from sea bream sca1es［J］.Process Biochem，2004，39（10）:1195-2000.

［18］SEKI E，OSAJIMA K，MATSUFUJI H，et a1.Angiotens in converting enzyme inhibitory activity of the short chain peptides derived from various food proteins［J］.Nippon Shkuhin Kagaku Kogaku Kaishi，1996，43（7）:839-840.

［19］CUSHMAN D W，CHEUNG H S.Spectrophoto metric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit 1ung［J］.Biochem Pharmol，1971，20:1637-1648.

［20］王莉娟，陶文沂.脫脂豆粕制備高水解度大豆肽酶解條件的優(yōu)化［J］.食品與機械，2008，24（1）：20-24.

［21］廖丹葵.雞蛋蛋黃蛋白質制備降血壓肽的研究［D］.南寧：廣西大學博士論文，2006.

Optimization of hydro1ysis techno1ogy of aba1one viscera

GUO Fang1，F(xiàn)ANG Ting2，CHEN Jinquan2
（1.Department of Life Science，Lü Liang University，Lü1iang 033000，China；
2.Co11ege of Food Science，F(xiàn)ujian Agricu1ture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Using aba1one viscera as raw materia1，the ACE inhibitory peptide was prepared by a1ka1ine proteinse hydro1ysis.Based on sing1e factor experiments，response surface methodo1ogy and Box-Behnken experiments were emp1oyed to optimize the hydro1ysis process of aba1one viscera.Using ACE inhibitoryrate aseva1uation index，the effectofhydro1ysistemperature，time and enzyme addition on ACE inhibitoryrate was investigated.Resu1ts indicated that the optima1 process was hydro1ysis temperature 52℃，pH 9.0，so1id-1iquid ratio 1∶3（g∶m1），enzyme addition 4.5%and hydro1ysis time 5.5 h.Under these conditions，the ACE inhibitory rate of protein hydro1ysis product from aba1one viscera was 79.72%.

aba1one viscera；enzymatic hydro1ysis；ACE inhibitory rate；response surface methodo1ogy

TS254.9；Q556.3

A

0254-5071（2015）12-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.022

2015-09-24

閩發(fā)改投資項目（［2014］168號）

郭芳（1985-），女，助教，碩士，研究方向為食品加工技術。