纖維素酶-壓熱法制備馬鈴薯抗性淀粉工藝參數優化

章麗琳，葉　陵，張　喻*（1.湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

纖維素酶-壓熱法制備馬鈴薯抗性淀粉工藝參數優化

章麗琳1，2，葉陵1，2，張喻1，2*
（1.湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

為了提高抗性淀粉的得率，并獲得抗性淀粉制備方法的最佳工藝參數，該試驗以馬鈴薯淀粉為原料，抗性淀粉得率為評價指標，采用纖維素酶-壓熱法制備馬鈴薯抗性淀粉。研究淀粉乳濃度、酶添加量、酶解時間、壓熱溫度、壓熱時間5個因素對馬鈴薯抗性淀粉得率的影響，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化得出馬鈴薯抗性淀粉的最佳制備工藝條件，即淀粉乳含量25%、淀粉乳pH 5.0、酶用量30 U/mL、酶解時間50 min、壓熱溫度125℃、壓熱時間30 min、老化溫度4℃、老化時間18 h，在此條件下抗性淀粉的得率為30.33%。

馬鈴薯抗性淀粉；纖維素酶；壓熱法；工藝優化

抗性淀粉（resistant starch，RS）是指不能在健康人體小腸中消化吸收，而能在大腸中被發酵分解的一類淀粉及其降解物，是一種具有良好生理功能和食品加工特性的原料［1］。其具有降低甘油三酯和膽固醇含量、預防直腸癌和腸道疾病、改善腸道菌群、預防糖尿病、促進維生素和礦物質的吸收等生理功能［2-4］。根據其來源和抗酶解性的不同可將其分為4類：物理包埋淀粉（RS1）、抗性淀粉顆粒（RS2）、老化淀粉（RS3）、化學改性淀粉（RS4）［5］。其中，RS3是淀粉糊化后發生老化，直鏈淀粉和支鏈淀粉的線性部分發生重結晶得到的一種難以消化的淀粉，該類淀粉對熱十分穩定，具有很高的商業價值［6］。

目前抗性淀粉的制備方法有壓熱法［7］、酶解法［8］、擠壓法［9］、微波結合酶法［10］等。其中，酶解法因其具有較高的安全性而被廣泛研究，所選用的酶主要有α-淀粉酶、普魯蘭酶、纖維素酶等［11］。纖維素酶處理可破壞纖維素等阻礙淀粉分子聚集的非淀粉物質，從而可大大提高回生抗性淀粉的得率［11］。壓熱法是制備回生抗性淀粉較為常用的方法，通過高溫高壓作用使一定濃度的淀粉乳充分糊化，再利用淀粉的老化特性，在低溫條件下靜置一定時間，使淀粉糊慢速冷卻形成老化淀粉，即回生抗性淀粉［12］。

馬鈴薯在國內種植面積廣、產量高，但至今仍處于加工利用初級階段。馬鈴薯淀粉比其他淀粉純度高、質量好、易轉化，適宜生產抗性淀粉［13］。本試驗將纖維素酶處理與壓熱法相結合制備RS3型馬鈴薯抗性淀粉，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗對工藝參數進行優化以確定最佳的酶解-壓熱工藝，具有一定的理論和實際應用價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

馬鈴薯淀粉（其中淀粉質量分數為83.5%，含水率為16.5%）：甘肅興達淀粉工業有限公司；纖維素酶（15000U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖淀粉酶（100 U/mg）、α-淀粉酶（4 000 U/g）：上海柏卡化學技術有限公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosa1icy1ic acid，DNS）、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、苯酚等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

ZHWY-C2102恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LMQ.J立式滅菌器：山東新華醫療器械股份有限公司；101-2AB電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DL-1電子可調電爐：北京中興偉業儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；WFJ-7200可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；MDJ-D4072磨豆機：廣東小熊電器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1馬鈴薯抗性淀粉制備的工藝流程

馬鈴薯淀粉→溶解→調pH值→糊化→加酶酶解→壓熱處理→自然冷卻→回生（4℃）→烘干→粉碎→過篩

1.3.2酶法-壓熱處理工藝操作要點

稱取一定質量的馬鈴薯淀粉，與水以一定比例混合，調pH至5.0，在80℃水浴中進行糊化，冷卻至適宜溫度，加入一定量纖維素酶進行酶解，放入高壓滅菌鍋中進行壓熱處理，一定時間后取出冷卻至室溫，于4℃靜置18 h，取出后于室溫放置4 h，后放入60℃烘箱中烘干，粉碎，過100目篩，得到成品。

1.3.3馬鈴薯抗性淀粉的測定方法

參考GO?I I等［14］研究方法，將抗性淀粉轉換為葡萄糖進行測定。稱取所制樣品5 g于100 mL燒杯中，加入pH值為1.5的HC1-KC1緩沖溶液25 mL，加入1 mL胃蛋白酶溶液，40℃恒溫振蕩1 h。用2 mo1/L HC1和0.5 mo1/L NaOH調節pH值為6.0，加入耐高溫α-淀粉酶溶液1 mL，在95℃恒溫振蕩30 min，水解可消化淀粉。調節pH值為4.0，加入1 mL葡萄糖淀粉酶溶液，70℃恒溫振蕩1 h，水解可消化淀粉為葡萄糖，冷卻、離心、棄去上清液，重復3次。加入5 mL 5 mo1/L 的KOH，水浴加熱并攪拌使抗性淀粉溶解，并用5mL5 mo1/L 的HC1進行中和，加入1mL葡萄糖淀粉酶溶液，60℃恒溫水浴并保持不斷振蕩1 h。室溫冷卻并離心，合并上清液，用蒸餾水定容至100 mL。

采用3，5-二硝基水楊酸（dinitrosa1icy1ic acid，DNS）法測定還原糖含量（以葡萄糖計），馬鈴薯抗性淀粉得率計算公式如下：

馬鈴薯抗性淀粉得率=還原糖含量×0.9

式中：0.9為葡萄糖與脫水葡萄糖基之間的換算系數。

1.3.4單因素試驗設計

在淀粉乳含量10%、淀粉乳pH 5.0、纖維素酶用量20U/mL、酶解溫度40℃、酶解時間60min、壓熱溫度120℃、壓熱時間30 min、老化溫度4℃、老化時間18 h的基礎上，相應變換某因素的水平：淀粉乳含量5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%；纖維素酶用量20U/mL、30U/mL、40U/mL、50 U/mL、60 U/mL、70 U/mL；酶解時間20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min；壓熱溫度110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃；壓熱時間20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。按1.3.1的方法制備抗性淀粉，1.3.3的方法測定抗性淀粉得率，考察各因素對抗性淀粉得率的影響。

1.3.5正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇淀粉乳含量、壓熱溫度、酶解時間為影響因素，以馬鈴薯抗性淀粉得率為評價指標，進行L9（33）正交試驗，探索最佳工藝條件，正交試驗因素與水平如表1所示。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1淀粉乳含量對抗性淀粉得率的影響

圖1　淀粉乳含量對抗性淀粉得率的影響Fig.1 Effect of starch milk content on resistant starch yield

由圖1可知，抗性淀粉得率隨淀粉乳含量增加而上升，當淀粉乳含量為20%時抗性淀粉得率最高，為22.6%，隨后逐漸降低，淀粉乳含量過高或過低都不利于抗性淀粉的形成。淀粉乳含量過低，水分含量過高，直鏈淀粉分子相互接近的概率減少，難以接近形成結晶；而淀粉乳含量過高，淀粉顆粒難以充分膨脹、糊化，淀粉糊黏度很大，分子鏈之間相互影響較大，不利于直鏈淀粉分子相互接近，形成抗雙螺旋和結晶［15］。故選擇淀粉乳含量為20%最佳。

2.1.2纖維素酶用量對抗性淀粉得率的影響

圖2　纖維素酶用量對抗性淀粉得率的影響Fig.2 Effect of cellulase addition on resistant starch yield

由圖2可知，纖維素酶用量對抗性淀粉得率的影響較小。抗性淀粉得率隨纖維素酶用量的增加而上升，當纖維素酶用量為30～40 U/mL時，抗性淀粉得率較高，隨后緩慢降低，纖維素酶用量過高或者過低都不利于抗性淀粉的形成。酶用量過低，分子被切斷程度不夠，分子鏈過長，不易形成晶體；酶用量過高，分子鏈被切的過短，小分子運動過快，不利于結晶的形成，同時伴隨生成的小分子糖類也會阻礙抗性淀粉的生成，同時也會使淀粉糊的黏度增大，不利于直鏈淀粉分子相互接近形成結晶［16］。因此選擇纖維素酶用量30 U/mL為宜。

2.1.3酶解時間對抗性淀粉得率的影響

圖3　酶解時間對抗性淀粉得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on resistant starch yield

由圖3可知，隨著酶解時間的增加，抗性淀粉得率逐漸增大，在酶解時間為50 min時，抗性淀粉得率最大，為16.9%，酶解時間繼續增加，抗性淀粉得率下降。其原因是纖維素酶的作用時間過短，釋放的直鏈淀粉分子太少，不利于結晶，而且淀粉糊中直鏈分子的鏈過長，太長的鏈分子間斥力增大；纖維素酶的作用時間過長，直鏈分子過短，分子質量小的直鏈分子則運動較快，分子運動比較劇烈，而運動快的鏈碰撞在一起及穩定的幾率相對較小，因此較難聚集，所以酶解時間過長，直鏈分子過短，也不利于晶體的形成［17］。因此選擇酶解時間50 min為宜。

2.1.4壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響

圖4　壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響Fig.4 Effect of autoclaving temperature on resistant starch yield

由圖4可知，壓熱溫度過高和過低都不利于抗性淀粉的形成，壓熱溫度在125℃時，抗性淀粉的得率較高，為17.2%。淀粉糊中抗性淀粉的形成可以看作是高聚物的結晶過程，高聚物的結晶過程與小分子類似，也包括晶核的形成和晶粒的生長兩個步驟，結晶的速度是由成核速度，晶體生長速度共同決定的［18］。壓熱溫度低時，淀粉糊黏度增大會抑制晶體的生成，使抗性淀粉的生成受阻；當壓熱溫度過高時，淀粉晶核遭到破壞，晶核不能夠正常形成，從而抑制了抗性淀粉的形成。因此選擇壓熱溫度125℃為宜。

2.1.5壓熱時間對抗性淀粉得率的影響

圖5　壓熱時間對抗性淀粉得率的影響Fig.5 Effect of autoclaving time on resistant starch yield

由圖5可知，壓熱時間對抗性淀粉得率的影響較小。隨著壓熱時間增加，抗性淀粉得率增大，當壓熱時間為30～50 min時抗性淀粉得率相對較高，壓熱時間繼續增加，抗性淀粉的得率會下降。壓熱時間過短，淀粉未充分吸水釋放出足夠的直鏈淀粉，直鏈淀粉分子尚未完全游離出來，不利于直鏈淀粉分子間相互接近形成結晶；壓熱時間過長，造成淀粉分子發生過度降解，產生一些相對分子質量小的短鏈直鏈淀粉，這也不利于抗性淀粉的形成。因此選擇壓熱時間30℃為宜。

2.2優化正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，固定纖維素酶用量為30 U/mL、壓熱時間為30 min，選擇淀粉乳含量、壓熱溫度、酶解時間進行L9（33）正交試驗確定制備馬鈴薯抗性淀粉的最佳工藝條件，正交試驗結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

表2　馬鈴薯抗性淀粉制備工藝條件優化正交試驗結果與分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal experiments for preparation processing conditions of potato resistant starch optimization

表3　正交試驗結果方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各試驗因素對抗性淀粉得率影響大小順序為：酶解時間＞淀粉乳含量＞壓熱溫度，最佳工藝組合為A3B2C2。在此工藝條件下進行驗證試驗，重復3次，得到抗性淀粉得率為30.42%、30.25%、30.33%，平均值為30.33%，高于正交試驗結果中最高得率，說明此正交優化得出的制備工藝條件可行。故采用纖維素酶-壓熱協同方法制備馬鈴薯抗性淀粉的最佳工藝組合為淀粉乳含量25%、纖維素酶用量30 U/mL、酶解時間50 min、壓熱溫度125℃、壓熱時間30 min。

由表3可知，淀粉乳含量、壓熱溫度、酶解時間對抗性淀粉得率具有顯著性影響（P＜0.05），且影響大小順序為酶解時間＞淀粉乳含量＞壓熱溫度。

3　結論

本研究以馬鈴薯淀粉為原料，抗性淀粉得率為評價指標，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，確定纖維素酶-壓熱法制備馬鈴薯抗性淀粉的最佳工藝條件為淀粉乳含量25%、淀粉乳pH 5.0、纖維素酶用量30 U/mL、酶解溫度40℃、酶解時間50 min、壓熱溫度125℃、壓熱時間30 min、老化溫度4℃、老化時間18 h。在此工藝條件下，馬鈴薯抗性淀粉的得率可達到30.33%。連喜軍等［7］單獨利用纖維素酶處理制備馬鈴薯抗性淀粉，其最高得率為17.748%；宋洪波等［12］單獨利用壓熱法制備淮山藥抗性淀粉，其最高得率為25.27%。說明纖維素酶處理與壓熱法結合能夠提高抗性淀粉制備得率。

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Optimization of ce11u1ase-autoc1ave method process parameters for preparation of potato resistant starch

ZHANG Li1in1，2，YE Lin1，2，ZHANG Yu1，2*
（1.Co11ege of Food Science and Techno1ogy，Hunan Agricu1tura1 University，Changsha 410128，China；2.Hunan Province the Key Laboratory of Food Science and Biotechno1ogy，Changsha 410128，China）

In order to improve the yie1d of resistant starch and obtain the optimum process parameters for potato resistant starch preparation，using the potato starch as raw materia1，resistant starch yie1d as eva1uation indexes，potato resistant starch was manufactured by ce11u1ose-autoc1ave method. The effects of starch mi1k content，enzyme addition，enzymo1ysis time，autoc1aving temperature and time on potato resistant starch yie1d were researched.By sing1e factor experiments and orthogona1 experiments，the optimum process parameters for preparation of potato resistant starch were starch mi1k content 25%，starch mi1k pH 5.0，enzyme 30 U/m1，enzymo1ysis time 50 min，autoc1aving temperature 125℃，autoc1aving time 30 min，aging temperature 4℃and aging time 18 h.Under the conditions，the yie1d of resistant starch was 30.33%.

potato resistant starch；ce11u1ase；autoc1ave method；process optimization

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.023

2015-10-27

湖南省教育廳優秀青年項目（11B061）

章麗琳（1991-），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。

張喻（1972-），女，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。