金銀花中綠原酸的雙水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳欽，向　福，2*，石長萍，吳　偉，方元平，2（.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃州 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃州 438000；3.湖北理工學院 醫學院，湖北 黃石 435003）

金銀花中綠原酸的雙水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳欽1，向福1，2*，石長萍1，吳偉2，3，方元平1，2
（1.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃州 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃州 438000；3.湖北理工學院 醫學院，湖北 黃石 435003）

為合理利用大別山金銀花資源，以羅田縣的金銀花及其莖、葉為試驗材料，利用雙水相體系萃取綠原酸，并研究了其抗氧化活性。結果表明：50 mL丙酮/磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件為酮水比8.5∶1.5（V/V），磷酸氫二鉀添加量3 g，水提液綠原酸質量濃度22.9 g/L。在此條件下，綠原酸含量為56.27%，收率為98.46%，且其綠原酸的羥基自由基清除能力較強，從而為大別山金銀花資源的開發利用提供了理論依據。

雙水相；金銀花；綠原酸；羥基自由基清除；抗氧化活性

金銀花（Lonicera japonica）藥用歷史悠久，是臨床常用的中藥之一，具有較高的使用價值［1］。綠原酸（ch1orogenic acid）是金銀花的主要藥效成分和評價成分，具有抗氧化、降血脂、降血糖、調節免疫、保護心腦血管的功能［2-5］。目前，從金銀花中分離純化綠原酸的主要方法有大孔樹脂吸附法、水提石灰乳沉淀法、超濾法、正丁醇分離法、β-環糊精包埋法、水提醇沉法、石灰硫酸法、異戊醇法和改良的醋酸乙酯法等［6-10］，這些分離純化方法存在綠原酸含量低、耗時長、操作繁瑣、有機溶劑殘存、環境不友好、生物相容性低等問題，難以適應工業化生產［11］。同時，綠原酸高溫下不穩定，易失活。

雙水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）是一種新型溶劑萃取的分離提純技術，提取過程能有效保護天然產物的生物活性［12］，且有選擇性強、易于放大的特點，適合大規模生產、操作簡單、生物親和性好、經濟簡便、快速高效且不存在有機溶劑殘存問題［13-14］，有效提高了天然活性物質分離純化的安全性和提取效率。

為便于產業化應用，本實驗以羅田縣的金銀花及其莖葉為實驗材料，基于酮水比、磷酸氫二鉀加入量和水提液綠原酸質量濃度3個因素，探討丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件，并研究其抗氧化活性，從而為大別山金銀花資源的開發利用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花（花莖葉整株采收）：羅田縣開發區金銀花基地，陰干，粉碎備用；綠原酸標準品（純度≥99%）：上海如吉生物科技有限公司；維生素C（vitaminC，VC）標準品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；丙酮（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）：天津凱通化學試劑有限公司；羥自由基清除能力測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設備

Varian Cary 100 Scan紫外可見分光光度計：美國Varian公司；Ax-205 METTLER TOLEDO電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；RE-4205旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠。1.3實驗方法

1.3.1金銀花水提液制備

根據參考文獻［15］中提取綠原酸的方法，稱取10 g金銀花粉末，用體積分數60%乙醇按料液比1∶3.5（g∶mL）浸提過夜，再按料液比1∶20（g∶mL）的沸水，水浴攪拌10 min，冷卻至室溫抽濾，在70℃濃縮至50 mL左右，制得金銀花水提液。

1.3.2綠原酸標準曲線的制作

準確稱取綠原酸標準品10mg，用超純水定容至100 mL，制得綠原酸標準溶液。取綠原酸標準溶液用紫外分光光度計于波長200～500 nm處掃描，確定檢測波長為322 nm。

分別吸取綠原酸標準溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中定容，在波長322 nm處測定吸光度值。綠原酸在0.005～0.050 g/L質量濃度范圍內與吸光度值呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.052 4x+0.003 8，相關系數R2=0.999 4。

1.3.3雙水相體系萃取單因素試驗

準確量取一定體積的金銀花水提液置于50 mL錐形瓶中，按比例加入一定體積的丙酮和一定質量的磷酸氫二鉀，振蕩，使其充分混勻，靜置過夜后分離上下兩相，測體積計算相比R，并在波長322 nm處測其吸光度值，根據標準曲線線性回歸方程計算綠原酸質量濃度和分配系數K。相比、分配系數和綠原酸收率的計算公式如下：

式中：R為相比；VA、VB分別為上、下相體積，mL；K為分配系數；CA、CB分別為上、下相中綠原酸質量濃度，g/L；Y為綠原酸收率，%。

1.3.4雙水相體系萃取條件正交試驗優化

在單因素試驗基礎上，對影響雙水相萃取主要因素進行正交試驗，以綠原酸收率Y為考察指標，確定50 mL雙水相體系萃取綠原酸的最佳條件。正交試驗因素與水平如表1所示。

表1　萃取條件優化正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5抗氧化能力檢測

分別配制綠原酸質量濃度為0.15g/L、0.30g/L、0.45 g/L、0.60 g/L和0.75 g/L的金銀花水提液、上相萃取液、綠原酸標品溶液，并以相同質量濃度的VC作為陽性對照，參照說明書混勻后，在37℃溫育60 min，將對照管、測定管、空白管樣液在波長536 nm處測定吸光度值，每管重復3次，羥自由基清除率計算公式如下：

式中：D為羥自由基清除率，%；OD1為測定管的吸光度值；OD2為對照管的吸光度值；OD3為空白管的吸光度值。

2　結果與分析

2.1雙水相萃取綠原酸單因素試驗

2.1.1酮水比對雙水相萃取綠原酸的影響

酮水比即丙酮和水的體積比，直接影響雙水相萃取效果。水量過多無法形成雙水相體系，過少則鹽不能完全溶解；丙酮量太少也無法形成雙水相，太多則會導致鹽的析出。在50mL雙水相體系中考察了酮水體積比分別為7.0∶3.0、7.5∶2.5、8.0∶2.0、8.5∶1.5、9.0∶1.0時雙水相萃取綠原酸的效果，結果如圖1所示。

圖1　酮水比對雙水相萃取綠原酸的影響Fig.1 Effect of acetone water volume ratio on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖1可知，當酮水比在7.0∶3.0～8.5∶1.5時，分配系數K穩定在1.00～1.54范圍波動，綠原酸收率則持續增加到88.63%。當酮水比為9.0∶1.0時，此時雙水相體系下相渾濁，導致分配系數K和收率Y分別急劇下降到0.05和39.57%。因此，丙酮/K2HPO4雙水相體系中，酮水比不僅影響雙水相的穩定性，也是影響綠原酸萃取效果的重要因素，酮水比越大，上相對綠原酸的富集效率越高，但酮水比太大則體系不穩定，在酮水比為8.5∶1.5時，雙水相體系構建最穩定，綠原酸收率最高，因此選擇酮水比8.5∶1.5進行下一步試驗。

2.1.2磷酸氫二鉀加入量對雙水相萃取綠原酸的影響

在酮水比8.5∶1.5條件下，在50 mL雙水相體系分別加入2 g、3 g、4 g、5 g、6 g K2HPO4，探討K2HPO4加入量對雙水相體系萃取綠原酸的影響，結果如圖2所示。

圖2　磷酸氫二鉀添加量對雙水相萃取綠原酸的影響Fig.2 Effect of K2HPO4addition on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖2可知，分配系數K和綠原酸收率Y均隨著K2HPO4加入量的增加出現先升后降的變化趨勢，在K2HPO4添加量為3 g時均達到最高值，分別為2.75和94.36%。因此K2HPO4加入量可以明顯影響雙水相體系萃取綠原酸的效果，50 mL丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取金銀花中綠原酸的K2HPO4最佳添加量為3 g。

2.1.3綠原酸質量濃度對雙水相萃取綠原酸的影響

配制綠原酸質量濃度分別為5.7g/L、11.5g/L、17.2 g/L、22.9 g/L、28.7 g/L的金銀花水提液構建50 mL雙水相體系，酮水比8.5∶1.5，加入K2HPO43 g，分配系數K、及綠原酸收率Y的變化結果如圖3所示。

圖3　綠原酸質量濃度對雙水相萃取綠原酸的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid content on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由圖3可知，分配系數K和綠原酸收率Y隨著金銀花水提液中綠原酸質量濃度的增加而增加，在綠原酸質量濃度為22.9 g/L時達到最大，分別比為12.26和98.46%。隨著綠原酸質量濃度繼續增加，分配系數K和綠原酸收率Y則開始下降，這可能是由于金銀花水提液中綠原酸質量濃度超過了雙水相萃取能力（如28.7 g/L），上相所能萃取容納的綠原酸達到飽和，多余的綠原酸仍保留在下相，從而導致分配系數和綠原酸收率的降低。因此，選擇選擇金銀花水提液中綠原酸質量濃度22.9 g/L進行下一步研究。

2.2雙水相萃取綠原酸正交優化試驗

為進一步優化雙水相體系萃取條件，選取酮水比（A）、磷酸氫二鉀添加量（B）和綠原酸質量濃度（C）為影響因素，以綠原酸收率（Y）為評價指標，進行3因素3水平正交優化試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2　萃取條件優化正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素對綠原酸萃取的影響次序為：A＞B＞C，即酮水比＞磷酸氫二鉀加入量＞綠原酸質量濃度。雙水相萃取綠原酸的最佳條件為A3B2C2，即在50 mL雙水相體系中，酮水比為8.5∶1.5，K2HPO4加入量為3 g，綠原酸質量濃度為22.9 g/L。由表3可知，酮水比對雙水相萃取綠原酸提取影響達到顯著水平（P＜0.05），其他因素對結果影響均不顯著。

2.3驗證試驗

在正交試驗最佳萃取條件下，驗證所得綠原酸收率為98.46%，大于正交表中最高綠原酸收率96.39%。為驗證其萃取作用，將金銀花水提液經濃縮干燥，測定綠原酸質量分數，平均值為16.20%。在A3B2C2最佳萃取條件下，上相萃取液經濃縮干燥，測定綠原酸質量分數，平均值為56.27%。丙酮/K2HPO4雙水相體系萃取后，所得金銀花提取物中綠原酸質量分數增加了2.47倍，表明該雙水相體系對綠原酸的萃取和純化作用明顯。

2.4抗氧化能力評價

以VC為陽性對照，檢測0.15 g/L、0.31 g/L、0.46 g/L、0.62 g/L和0.77 g/L等系列綠原酸質量濃度下金銀花水提液、雙水相上相萃取液、綠原酸標品溶液的羥基自由基清除能力，結果如圖4所示。

羥基自由基作用于體內蛋白質、核酸、脂類等生物分子，造成細胞結構和功能受損，進而導致體內代謝紊亂引起疾病［16］。羥基自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要評價指標之一。由圖4可知，3種含不同質量濃度綠原酸的樣液，以綠原酸標品溶液羥基自由基清除率最低，隨著綠原酸質量濃度的增加，樣品液羥基自由基清除能力增強。質量濃度增加到0.75g/L時，水提液羥基自由基清除率最高，為98%；其次是上相萃取液，為82%；綠原酸標品溶液最低，為78%，但均比VC羥基自由基清除率高。因此，金銀花綠原酸提取物具有較強的羥基自由基清除能力。

圖4　綠原酸樣品的羥自由基清除能力Fig.4 Scavenging hydroxyl radical activity of chlorogenic acid samples

金銀花水提液中黃酮類、酚類、多糖類等抗氧化物質的存在，強化了其低濃度時的羥自由基清除能力［17］，使得綠原酸質量濃度為0.15g/L時，水提液羥自由基清除率優勢明顯，是VC標準品液的6.6倍。隨著綠原酸質量濃度的增加，上相萃取液和綠原酸標品溶液的羥自由基清除率與水提液的差距逐漸縮小，使得水提液羥自由基清能力雖然最強，但優勢減弱，僅為VC標準品液的1.9倍，而上相萃取液和綠原酸標品液的羥自由基清除率基本相近，分別為VC標準品液的1.6倍和1.5倍。這是由于雙水相選擇性萃取富集了水提液中綠原酸，其羥自由基清除率與綠原酸標品液接近，但由于仍存在黃酮類等物質，使其羥自由基清除率略高于綠原酸標品溶液。

3　結論

試驗以羅田縣的金銀花及其莖葉為試驗材料，建立了50 mL丙酮/K2HPO4雙水相體系選擇性萃取金銀花中綠原酸的工藝，最佳條件為酮水體積比8.5∶1.5，K2HPO4添加量3 g，水提液中綠原酸質量濃度22.9 g/L。此條件下綠原酸收率為98.46%，含量為56.27%。

雙水相對金銀花綠原酸的萃取和純化作用明顯，所得綠原酸具有較強的清除羥基自由基的作用，對大別山金銀花資源的合理開發和科學利用具有現實意義和應用前景。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［2］DE SOTILLO D V R，HADLEY M.Ch1orogenic acid modifies p1asma and 1iver concentrations of:cho1estero1，triacy1g1ycero1，and minera1s in （fa/fa）Zucker rats［J］.J Nutr Biochem，2002，13（12）:717-726.

［3］NICASIO P，AGUILAR-SANTAMARIA L，ARANDA E，et a1.Hypog1ycemic effect and ch1orogenic acid content in twoCecropiaspecies［J］. Phytother Res，2005，19（8）:661-664.

［4］ABOA-KARAM M，SHIER WT.Iso1ation and characterization of an antivira1 f1avonoid fromWa1dsteinia fragarioides［J］.J Natu Prod，1992，55（10）:1525-1527.

［5］趙國玲，劉佳佳，林丹，等.金銀花化學成分及藥理研究進展［J］.中成藥，2002，24（12）：973-976.

［6］王海燕，張仕華，趙謀明，等.煙草綠原酸分離純化及其抑菌性研究［J］.現代食品科技，2008，24（3）：233-236，213.

［7］張毅敏，譚天偉.環糊精鍵合凝膠介質分離純化金銀花中綠原酸［J］.過程工程學報，2009，9（5）：969-974.

［8］黃榮，向福，馬文靜，等.微波輔助PEG提取金銀花葉中綠原酸的工藝優化［J］.中國釀造，2015，34（8）：119-124.

［9］李文娜，肖苑，陳陽.杜仲葉綠原酸分離純化工藝比較及其抗氧化性研究［J］.中醫藥導報，2011，17（12）：65-67.

［10］張平，蘇小飛，方桐輝，等.石油醚、乙酸乙酯預處理在金銀花綠原酸萃取中的應用研究［J］.安徽科技，2009（2）：51-52.

［11］趙昕梅，遠凌威.金銀花中綠原酸提取工藝研究［J］.科技創新導報，2014（32）：42-43.

［12］RAMESH V，MURTY V R.Partitioning of thermostab1e g1ucoamy1ase in po1yethy1eneg1yco1/sa1t aqueous two-phase system［J］.Bioresour Bioproc，2015，2（1）:1-8.

［13］ROSA P A J，AZEVEDO A M，SOMMERFELD S，et a1.Continuous purification of antibodies from ce11 cu1ture supernatant with aqueous two-phasesystems:Fromconcepttoprocess［J］.Biotechnol J，2013，8（3）: 352-362.

［14］BREYDO L，MIKHEEVA L M，MADEIRA P P，et a1.So1vent interaction ana1ysis of intrinsica11y disordered proteins in aqueous two-phase systems［J］.Molec Biosyst，2013，9（12）:3068-3079.

［15］向福，劉亮，秦婷，等.羅田金銀花葉中綠原酸的提取工藝改進［J］.食品與機械，2013，29（6）：150-152，196.

［16］VECCHIA C，DECARLI A，SERAFINI M，et a1.Dietary tota1 antioxidant capacity and co1orecta1 cancer:A 1arge case-contro1 study in Ita1y ［J］.Int J Cancer，2013，133（6）:1447-1451.

［17］李偉.扛板歸及苦菜黃酮類物質超聲波提取工藝優化及其抗氧化活性［J］.中國釀造，2014，33（2）：78-81.

Aqueous two-phase extraction and antioxidant activity of ch1orogenic acid in honeysuck1e

HU Jiaqin1，XIANG Fu1，2*，SHI Changping1，WU Wei2，3，FANG Yuanping1，2
（1.Co11ege of Life Sciences，Huanggang Norma1 University，Huangzhou 438000，China；2.Hubei Co11aborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exp1oitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；3.Schoo1 of Medicine，Hubei Po1ytechnic University，Huangshi 435003，China）

For reasonab1e uti1ization of Dabie Mountains honeysuck1e resources，using the f1owers，branches and 1eaves of honeysuck1e as test materia1s，the ch1orogenic acid was extracted by aqueous two-phase system，and the antioxidant activity was researched.Resu1ts indicated that the optimum extraction conditions of ch1orogenic acid in 50 m1 acetone and K2HPO4aqueous two-phase system were ketone-water ratio 8.5∶1.5（V/V），K2HPO4addition 3 g，water extract ch1orogenic acid content 22.9 g/L.Under the conditions，the content and yie1d of ch1orogenic acid was 56.27%and 98.4%，respective1y.The ch1orogenic acid had a good capacity of scavenging hydroxy1 radica1，which provided a theoretica1 basis for the deve1opment and app1ication of Dabie Mountains honeysuck1e resources.

aqueous two-phase；honeysuck1e；ch1orogenic acid；hydroxy1 radica1 scavenging；antioxidant activity

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.024

2015-10-26

湖北省自然科學基金重點項目（2014CFA129）

胡佳欽（1994-），男，本科生，研究方向為天然植物資源利用。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向為天然植物資源利用。