水酶法提取葡萄籽中蛋白質工藝的研究

尹　佳，王　璐，孫健英，蔡瑩瑩，隋　新*（吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022）

水酶法提取葡萄籽中蛋白質工藝的研究

尹佳，王璐，孫健英，蔡瑩瑩，隋新*
（吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022）

采用木瓜蛋白酶對脫脂葡萄籽進行酶解提取蛋白質。在單因素試驗基礎上，考察酶用量、酶解溫度、pH值、反應時間和料液比對葡萄籽蛋白質提取率的影響，采用響應面法對葡萄籽蛋白質水酶法提取條件進行了優化。結果表明，葡萄籽蛋白質的最優提取條件為：酶解溫度40℃，料液比1∶25（g∶mL），酶用量4%，酶解時間45 min。在此優化條件下，葡萄籽蛋白質提取率為67.85%。

水酶法；葡萄籽蛋白質；響應面法；提取條件

我國是世界上重要的葡萄類產品的生產大國，在生產加工過程中會產生大量的副產物：葡萄籽和葡萄皮。葡萄籽占鮮葡萄質量的4%～7%，其含有大量的脂類、蛋白質和多酚類物質［1-2］。目前，對葡萄籽開發利用主要集中在葡萄籽油和多酚類物質的提取與利用方面，而對葡萄籽蛋白質的提取利用方面介紹較少。葡萄籽中粗蛋白的含量達8.9%，其含有18種氨基酸，包括人體需要的8種必需氨基酸，所以葡萄籽蛋白質是優質的蛋白質資源［3］。從1979年以來國外就試著采用各種方法來有效提取葡萄籽蛋白，如傳統的堿溶法、鹽溶法，其研究重點是如何最大限度地提取葡萄籽蛋白而盡量避免蛋白質與酚類物質結合，從而造成蛋白顏色深，消化性降低等問題［4-5］。夏輝等［6］采用堿溶酸沉法對脫脂后的葡萄籽蛋白質進行了提取研究，最大提取率達到70.6%。吳炳云等［7］采用酶法對葡萄籽中蛋白質進行提取，提取率可達89.94%。采用水酶法提取蛋白質比常規方法具有諸多優點如反應條件溫和、反應溫度低、以水為提取溶劑安全高效、提取的蛋白質質量好、變性程度小、色澤淺等。本研究通過響應面法優化水酶法提取葡萄籽蛋白質工藝，以期為開發葡萄籽蛋白質資源用于生產精蛋白、味精、功能性食品和保健藥品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄籽：產自新疆；木瓜蛋白酶（酶活50萬U/g）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：北京奧博星生物技術有限責任公司。

氫氧化鈉、石油醚（沸程30～60℃）、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、無水乙醇、濃硫酸、鹽酸均為分析純：上海化學試劑總廠。

1.2儀器與設備

HHS電熱恒溫水浴鍋、722可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器：上海金鵬分析儀器有限公司；TGL2050M臺式高速冷凍離心機：湖南瀘康離心機有限公司；FA1004A電子分析天平：上海精科天平制造廠；PHS-3CpH計：上海偉業儀器廠；S22-2磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；SKD-200全自動凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1提取方法

經粉碎過60目篩的葡萄籽粉，加入石油醚（料液比1∶25 （g∶mL））于常溫下磁力攪拌脫脂6～8 h，真空抽濾，重復3次之后合并濾液，真空旋轉蒸發濾液，干燥得到脫脂葡萄籽粉。稱取1 g脫脂葡萄籽粉按一定比例加入磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，加一定量酶，在一定的溫度、pH值條件下浸提一段時間后，80℃滅酶10 min，4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為葡萄籽蛋白質提取液。將提取液調節至蛋白質等電點（isoe1ectric point，PI），4 000 r/min離心15min得到沉淀，將沉淀進行真空冷凍干燥得到粗蛋白［8-9］。

1.3.2葡萄籽蛋白質等電點的測定［10］

用4 mo1/L鹽酸調節葡萄籽蛋白質提取液的pH值，分別為3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6和4.7，離心分離后將上清液在波長595 nm處進行比色測定，吸光度值最小的即為蛋白質等電點。

1.3.3蛋白質含量的測定

（1）牛血清蛋白標準曲線的制作［11］

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法。牛血清蛋白標準曲線的制作：取6支15 mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各個試管中溶液倒轉混合，靜置5 min后，在波長595 nm處下測其吸光度值A，記錄各管測定的吸光度值A。

表1　牛血清蛋白標準曲線制備Table 1 Standard curve preparation of bovine serum albumin

（2）提取液中蛋白質含量的測定

稱取脫脂葡萄籽粉末1 g，按1.3.1操作得到葡萄籽蛋白質提取液。取100 μL上清液于具塞比色管中，加入900 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍G-250試劑。蓋塞后，將各試管中溶液倒轉混合，放置5 min，在波長595 nm處測其吸光度值A，記錄數值。以牛血清蛋白標準曲線回歸方程，計算提取液中蛋白質含量。

（3）葡萄籽粉中總蛋白質含量的測定［12］

葡萄籽粉中總蛋白質含量的測定參照國標GB5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。

（4）蛋白質提取率的計算［13］

蛋白質提取率的計算公式如下：

1.3.4單因素試驗

以蛋白質提取率為評價指標，分別考察酶用量（1%、 2%、3%、4%、5%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、酶解溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）、酶解時間（30min、35min、40min、45min、55min）及pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對蛋白質提取率的影響。

1.3.5響應面優化試驗工藝條件

在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，研究酶解溫度（X1）、料液比（X2）、酶用量（X3）、酶解時間（X4）等因素綜合對葡萄籽蛋白質提取率的影響，以葡萄籽蛋白質提取率（Y）為響應值，確定葡萄籽蛋白質的最優提取工藝。響應面試驗因素與水平編碼見表2。

表2響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2　結果與分析

2.1葡萄籽蛋白質等電點的測定

葡萄籽蛋白質提取液的吸光度值隨pH值變化曲線如圖1所示。由圖1可知，pH值為3.8時，上清液的吸光度值最小，所以此點即為葡萄籽蛋白質的等電點，即pH=3.8。

圖1　吸光度值隨pH值變化曲線Fig.1 The changes curve of absorbance value with pH

2.2考馬斯亮藍法測定蛋白質含量標準曲線

圖2　牛血清蛋白標準曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin

提取液中蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清蛋白質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖2所示。

由圖2可知，標準曲線的線性回歸方程為y=0.000 9x+ 0.005 5，相關系數R2=0.999 7，表明蛋白質含量與吸光度值呈現良好的線性關系。

2.3單因素試驗結果

2.3.1酶用量對葡萄籽蛋白質提取率的影響

酶用量對葡萄籽蛋白質提取率的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著酶用量的上升，蛋白質提取率也隨之提高，當酶用量為4%時，蛋白質提取率達到最大，為54.23%；酶用量＞4%之后，蛋白質提取率出現輕微下降。酶用量的增加，提高了蛋白質的溶解度。但進一步增加酶用量，提取率不會提高，這可能是因為蛋白質受到酶的過度水解，空間結構受到破壞［14］。因此，選取最適酶用量4%為宜。

2.3.2酶解溫度對葡萄籽蛋白質提取率的影響

圖3　酶用量對蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on protein extraction rate

酶解溫度對葡萄籽蛋白質提取率的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著溫度的上升，蛋白質提取率也隨之提高。當溫度達到40℃時，提取率達到最大值為55.04%；隨后繼續升高溫度，蛋白質提取率下降。這可能是因為酶對底物作用在最適條件下反應速率最快，當溫度過高時導致酶失去活性，降低反應速率。因此，選取酶解溫度40℃為宜。

圖4　酶解溫度對蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on protein extraction rate

2.3.3料液比對葡萄籽蛋白提取率的影響

料液比對葡萄籽蛋白質提取率的影響結果見圖5。由圖5可知，隨著料液比的增加，蛋白質提取率也隨之增加。料液比達到1∶25（g∶mL）時提取率最大，此后提取率隨料液比的減小而降低。料液比過小，體系流動性差，酶與底物作用小；料液比過大，會使體系中酶濃度降低，降低反應速率。因此，選擇最適料液比1∶25（g∶mL）為宜。

2.3.4酶解時間對葡萄籽蛋白提取率的影響

圖5　料液比對蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate

酶解時間對葡萄籽蛋白質提取率的影響結果見圖6。由圖6可知，在35～45 min的反應時間內，蛋白質提取率增長速率很快；當酶解時間到45 min之后，隨著酶解時間的延長，蛋白質的提取率變化不大。酶解時間過長會使底物減少，反應速率減緩，蛋白質發生變性。因此，酶解時間選取45 min為宜。

2.3.5pH值對葡萄籽蛋白提取率的影響

圖6　酶解時間對蛋白質提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on protein extraction rate

pH值對葡萄籽蛋白質提取率的影響結果見圖7。由圖7可知，在pH為6.0～7.5范圍內，隨著pH值的上升，蛋白質提取率增加，在pH值為7.5時，提取率最高，為44.22%；而在pH值為7.5～8.5的范圍內蛋白質提取率隨著pH值的升高而降低，這可能是因為木瓜蛋白酶的最適pH值為7.0～8.0，超過這個范圍，酶的活性降低，導致提取率下降。因此，選擇最適pH 7.5為宜。

2.4響應面法提取條件的優化

圖7　pH對蛋白質提取率的影響Fig.7 Effect of pH on protein extraction rate

2.4.1響應面試驗設計及結果

根據響應面分析法設計原理，在單因素試驗的基礎上，對葡萄籽中蛋白質的提取工藝進行優化。固定酶解pH值為7.5，選取酶解時間（X1）、酶用量（X2）、料液比（X3）、酶解溫度（X4）作為自變量，以葡萄籽蛋白質提取率（Y）為響應值［15-16］。響應面試驗設計及結果見表3。

表3響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments

采用響應面統計方法對表3試驗結果進行多元擬合，建立響應面二次回歸模型為：

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，響應面數據的方差分析結果見表4。

表4　回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的；失擬項P=0.136 7＞0.05，說明方程具有很好的擬合度；模型R2=0.985 7，說明98.57%的試驗數據的變異性可用此模型來解釋，因此，可以用該模型對響應值進行預測［17］。一次項X3、X4差異極顯著，說明他們對響應值的影響極大。由F檢驗可得影響因素主次順序為：酶解溫度＞料液比＞酶用量＞酶解時間。考察因素間的交互作用，酶解時間和料液比的交互作用與酶用量和料液比的相互作用達到了顯著。

2.4.2響應面分析結果

通過Design-Expert8.0.6軟件繪制響應面及等高線，結果見圖8。

由圖8可知，料液比和酶解時間，料液比和酶用量之間的交互作用顯著、影響最大，酶用量和酶解時間之間，酶解溫度和酶解時間之間，酶解溫度和酶用量之間，酶解溫度和料液比之間水解度交互作用不顯著。采用響應面軟件程序優化，得到葡萄籽蛋白質提取的最優條件為酶解溫度39.69℃，料液比24.52（g∶mL），酶用量4%，酶解時間45.21min。在此最佳提取條件下，蛋白質的提取率為68.07%。

圖8　料液比、酶解時間、酶解溫度和酶用量交互作用對蛋白質提取率影響的響應面及等高線Fig.8 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between solid-liquid ratio，enzymolysis time，enzymolysis temperature and enzyme dosage on protein extraction rate

2.4.3驗證試驗

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優化的測定條件進行水酶法提取葡萄籽蛋白的試驗，考慮到實際操作情況，將數值修正為酶解溫度40℃，料液比1∶25 （g∶mL），酶用量4%，反應時間45 min。在此最優條件下，進行3次平行試驗，葡萄籽蛋白質提取率的平均值為67.85%，與回歸方程所得的預測值非常接近，說明該模型能較好地預測葡萄籽中蛋白質的提取率。

3　結論

選用木瓜蛋白酶提取脫脂葡萄籽粉中的蛋白質，在單因素基礎上，通過響應面法優化蛋白質的提取工藝。響應面分析結果顯示，影響蛋白質提取率主次因素順序為：酶解溫度＞料液比＞酶用量＞酶解時間，其最優提取條件為：酶解溫度40℃，料液比1∶25（g∶mL），酶用量4%，酶解時間45 min。在此條件下，葡萄籽蛋白質提取率為67.85%。

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Extraction techno1ogy of protein from grape seeds by aqueous enzymatic method

YIN Jia，WANG Lu，SUN Jianying，CAI Yingying，SUI Xin*
（Co11ege of Bio1ogy and Food Engineering，Ji1in Institute of Chemica1 Techno1ogy，Ji1in 132022，China）

Protein was extracted from defatted grape seeds by hydro1ysis of papain.Base on sing1e factor experiments，the effect of enzyme addition，enzymo1ysis temperature，pH，time and so1id-1iquid ratio on grape seed protein extraction rate was investigated.Aqueous enzymatic method extraction conditions of grape seeds protein were optimized by response surface methodo1ogy.Resu1ts indicated that the optimum extraction conditions were as fo11ows:enzymo1ysis temperature 40℃，so1id-1iquid ratio 1∶25（g∶m1），enzyme addition 4%and enzymo1ysis time 45 min.Under this condition，the grape seed protein extraction rate was 67.85%.

aqueous enzymatic method；grape seeds protein；response surface methodo1ogy；extraction conditions

TS261.9

A

0254-5071（2015）12-0122-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.027

2015-09-08

吉林省大學生創新創業訓練計劃項目（吉教高字［2015］17號）

尹佳（1983-），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術與功能性食品。

隋新（1972-），男，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術與功能性食品。