非洲紫羅蘭組培體系中卡那霉素的抗性篩選

國會(huì)艷　李繼光　張春蕊等

摘要： 采用組織培養(yǎng)技術(shù)，在非洲紫羅蘭組培過程中的愈傷組織誘導(dǎo)、芽的分化、生根階段分別進(jìn)行不同濃度卡那霉素（Kan）的抗性篩選。結(jié)果表明，在愈傷組織誘導(dǎo)階段，Kan濃度為60 mg/L時(shí)外植體的愈傷誘導(dǎo)受到抑制；在芽的分化階段，Kan濃度為80 mg/L時(shí)芽的增殖受到抑制；在生根階段，Kan濃度為120 mg/L時(shí)生根受到抑制。

關(guān)鍵詞： 卡那霉素；抗性篩選；非洲紫羅蘭

中圖分類號： S681.204+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0056-02

自1983年成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來 [1]，關(guān)于轉(zhuǎn)基因的研究越來越多，世界轉(zhuǎn)基因市場總收入超過30 000億美元，僅轉(zhuǎn)基因植物種子的收入可達(dá)3 000億美元 [2]。目前已成功獲得200多種轉(zhuǎn)基因植物，3 000多例轉(zhuǎn)基因植物已進(jìn)入大田試驗(yàn)階段 [3]。在植物的轉(zhuǎn)基因研究中，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因常被作為選擇標(biāo)記基因，該基因編碼氨基糖苷-3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶（aminnoglycoside-3′-phosphotransferase）Ⅱ，又稱npt-Ⅱ（neomycin phosphotransferaseⅡ），該酶使氨基糖苷類抗生素（卡那霉素、新霉素、巴龍霉素G418等）磷酸化而失活 [4]；因此，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因可用作遺傳轉(zhuǎn)化過程中區(qū)分轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的標(biāo)記 [5]。卡那霉素（kanamycin，Kan）影響線粒體和葉綠體的核糖體70S起始復(fù)合物生成，使蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡 [6]。根據(jù)其特性，對以npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因后代株系進(jìn)行篩選，后代發(fā)生分離，含目的基因的株系一定攜帶npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因，對卡那霉素處理不敏感；不含目的基因的植株不具有卡那霉素抗性，對卡那霉素處理敏感。目前，利用Kan對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行篩選已經(jīng)應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、番茄等作物 [7]。不同植物、不同類型的外植體應(yīng)使用不同濃度的卡那霉素，使其有效抑制未轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞生長并使之緩慢死亡，又不影響轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞正常生長。抗生素濃度過低雖不影響轉(zhuǎn)化株的正常生長，但可能出現(xiàn)嵌合體和假陽性現(xiàn)象；抗生素濃度過高則毒性過強(qiáng)，會(huì)快速殺死細(xì)胞，而死細(xì)胞對鄰近活細(xì)胞常有較強(qiáng)的抑制作用，不利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長 [8]。非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha）為非洲苦苣苔科多年生草本植物，原產(chǎn)于非洲坦桑尼亞海拔700～1 000 m [JP3]的烏桑巴拉山，是一種觀賞價(jià)值較高的室內(nèi)盆栽花卉，被譽(yù)為“室內(nèi)花卉皇后” [9-10]。植物基因工程不僅廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的改良，也是花卉改良的主要手段，[JP2]本試驗(yàn)確定了非洲紫羅蘭組培體系中的卡那霉素抗性篩選濃度，為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因研究提供依據(jù)，并為花卉品種的改良提供全新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲紫羅蘭組培苗（組培室培養(yǎng)）、卡那霉素、6-BA、NAA。生芽培養(yǎng)基配方為：MS、0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA。生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS、0.01 mg/L NAA。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 配制誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基時(shí)，分別加入濃度為20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一濃度至少配制6瓶培養(yǎng)基。挑選生命力強(qiáng)的組培苗葉片，將其切成小方塊并接種至不同Kan濃度的培養(yǎng)基中，各瓶接種相同數(shù)量的外植體。置于組培室中，在25 ℃下光照培養(yǎng)約20 d，定期觀察并記錄。

1.2.2 芽的分化 配制芽分化培養(yǎng)基時(shí)，分別加入濃度為20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一濃度至少配制6瓶培養(yǎng)基。將非洲紫羅蘭的不定芽接種至不同Kan濃度的芽增殖培養(yǎng)基中，各瓶接種相同數(shù)量的芽體。置于組培室中，在 25 ℃ 下光照培養(yǎng)約20 d，定期觀察并記錄。

1.2.3 根的生長 配制生根培養(yǎng)基時(shí)，分別加入濃度為60、80、100、120 mg/L的Kan，同一濃度至少配制6瓶培養(yǎng)基。將非洲紫羅蘭的不定芽接種至不同Kan濃度的生根培養(yǎng)基中，各瓶接種相同數(shù)量的芽體。置于組培室中，在25 ℃下光照培養(yǎng)約20 d，定期觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)階段Kan濃度的篩選

Kan濃度為20（圖1-A）、40 mg/L（圖1-B）時(shí)非洲紫羅蘭外植體顏色較綠；Kan濃度為60 mg/L（圖1-C）時(shí)外植體發(fā)黃；Kan濃度為80（圖1-D）、100 mg/L（圖1-E）時(shí)外植[CM（25]體失綠褐化。可見，愈傷組織誘導(dǎo)階段的Kan濃度為

[FK（W17][TPGHY1.tif]

60 mg/L 時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)受到抑制。

2.2 芽分化階段Kan濃度的篩選

在Kan濃度為20（圖2-A）、40（圖2-B）、60 mg/L（圖2-C）的芽增殖培養(yǎng)基中，外植體生長良好，葉片顏色較綠；Kan濃度為80（圖2-D）、100 mg/L（圖2-E）時(shí)芽體枯黃，失去芽增殖能力。可見，芽分化階段的Kan濃度為 80 mg/L 時(shí)，芽的分化受到抑制。

[FK（W17][TPGHY2.tif]

2.3 生根階段Kan濃度的篩選

在Kan濃度為60（圖3-A）、80 mg/L（圖3-B）的生根培養(yǎng)基中，植株可正常生根；Kan濃度為100 mg/L（圖3-C）時(shí)，僅部分植株能夠生根，其余植株無根生長；Kan濃度為120 mg/L（圖3-D）時(shí)，植株的生根完全被抑制。可見，生根階段的Kan濃度為120 mg/L時(shí)，植株完全喪失生根能力，后續(xù)試驗(yàn)可用此濃度篩選去除轉(zhuǎn)基因陰性株系。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用組織培養(yǎng)的方法，將非洲紫羅蘭的外植體接

種于不同Kan濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，在愈傷組織誘導(dǎo)階段，Kan濃度為60 mg/L時(shí)外植體的愈傷誘導(dǎo)受到抑制；在芽的分化階段，Kan濃度為80 mg/L時(shí)芽的增殖受到抑制；在生根階段，Kan濃度為120 mg/L時(shí)根的生長受到抑制。

在植物轉(zhuǎn)化過程中，必須通過篩選才能獲得轉(zhuǎn)基因成功的植株，將卡那霉素作為一種篩選劑加入選擇培養(yǎng)基中，以便對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。卡那霉素濃度的高低直接影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長 [11]。不同植物、同一植物不同外植體對卡那霉素的敏感性均可能存在差異，因此篩選濃度各不相同。轉(zhuǎn)化前應(yīng)設(shè)置不同的卡那霉素濃度梯度，找到植物最為敏感的卡那霉素濃度，以便在適當(dāng)條件下有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長并使其緩慢死亡，從而準(zhǔn)確篩選出轉(zhuǎn)基因陽性株系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳光中. 安全性的爭議[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，3（9）：405-406.

[2]杜建中，孫 毅，王景雪，等. 轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因的遺傳表達(dá)及其抗病性研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1720-1727.

[3]李劍芳，鄔敏辰，王 琴. 基因食品機(jī)器安全性研究進(jìn)展[J]. 江蘇食品與發(fā)酵，2003（3）：8-12.

[4]Wang G L，F(xiàn)ang H J. Plant genetic engineering[M]. 2nd ed.Beijing：Sience Press，2002：527-606.

[5]姚春馨，許明輝，李進(jìn)斌，等. 轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶-葡聚糖酶雙價(jià)基因水稻稻米毒理試驗(yàn)[J]. 中國糧油學(xué)報(bào)，2007，22（4）：18-23.

[6]趙 爽，雷建軍，陳國菊，等. 卡那霉素在轉(zhuǎn)基因芥菜中的應(yīng)用[J]. 遺傳，2008，30（4）：501-507.

[7]歐陽波，龍 芳，張揚(yáng)勇，等. 利用轉(zhuǎn)基因標(biāo)記NPT[QX（Y15]Ⅱ[QX）]快速、規(guī)模化純合轉(zhuǎn)基因番茄[J]. 武漢植物學(xué)研究，2006，24（1）：12-16.

[8]景 嵐，孫燕飛，張 崗，等. 油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系中卡那霉素濃度的篩選及抑菌劑的選擇[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（1）：102-105.

[9]裴仁濟(jì)，陳小強(qiáng)，孫 寧，等. 花色模式植物——非洲紫羅蘭[J]. 北方園藝，2010（11）：219-222.

[10] 陸 帥，董永輝，陳 佳. 非洲紫羅蘭形態(tài)特征及繁殖技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)村科技，2009，43（6）：39.

[11]王關(guān)林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：527-528.