鴨甲型肝炎病毒1型3C基因的原核表達與多抗的制備

王安平　朱善元　王永娟

摘要： 以血清1型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-1） SH株 3C 基因為序列設計1對特異性引物，RT-PCR方法進行擴增，克隆入原核表達載體pET-32a，轉化大腸桿菌BL21（DE3），在IPTG誘導下重組蛋白并獲得成功表達，該重組蛋白分子量約為38 ku，能與多聚組氨酸標簽單抗發生特異性反應。將目的蛋白切膠免疫ICR小鼠，制備重組蛋白的多抗血清，經Western-blot分析證明，制備的抗血清能夠與DHAV-1感染的SPF雞胚尿囊液總蛋白發生特異反應。 3C 基因在大腸桿菌中可獲得成功表達，制備的多抗血清可用于3C蛋白的檢測。

關鍵詞： 鴨甲型肝炎病毒； 3C 基因；原核表達；多抗

中圖分類號： S858 32 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0205-02

鴨病毒性肝炎（DHV）是一種急性、高度致死性病毒傳染病，可引起21日齡以下的雛鴨發生急性肝炎，病死率高達100%，是嚴重危害養鴨業的疫病之一。鴨病毒性肝炎較早認為有3個血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，國內外主要發生和流行的是Ⅰ型鴨肝炎病毒（DHV-Ⅰ） [1-2]。2005年7月，國際病毒分類委員會發表最新病毒分類第八次報告，認為DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ應歸屬于星狀病毒科；而2008年后，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，并稱之為鴨甲型肝炎病毒（DHAV），包括經典型（我國原Ⅰ型鴨肝炎病毒）、臺灣新型、韓國新型3種亞型，分別為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3 [3-5]，其中，DHAV-1呈世界性分布，是中國DHAV流行的主要血清型。

DHAV粒子呈二十面體對稱，直徑為20～40 nm，無囊膜，核心為單股正鏈的RNA，整個基因組約有7 690個核苷酸組成，不含5′帽子結構，3′端有poly（A）尾巴，只有1個較大的開放讀碼框，病毒RNA 指導合成1條完整的多聚蛋白。多聚蛋白在翻譯過程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，分解成VP0、VP3、VP1 3個結構蛋白和2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C、3D 9個非結構蛋白等。3C蛋白是具有水解多聚蛋白活性的蛋白水解酶，在多聚蛋白水解、病毒復制和形成過程中發揮重要的作用 [6-7]。目前，關于DHV主要集中于基因組序列測定與分型、結構蛋白表達及診斷制劑的研究，對于3C蛋白功能的研究還未見報道 [8-11]。本研究利用大腸桿菌轉化系統表達DHAV-1 SH株的 3C 基因，制備其多抗血清，為3C蛋白的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1 1 毒株、菌株和載體

DHAV-1 SH毒株，由中國上海獸醫研究所惠贈；10日齡SPF雞胚，購于江蘇農牧科技職業技術學院國家水禽基因庫；pET-32a載體、大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α，均為江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室保存。

1 2 酶和相關試劑

Trizol試劑盒，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉錄酶，購自Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和SacⅠ，購于Fermentas 公司；His標簽單抗、HRP-羊抗鼠IgG、質粒小提試 劑盒、DAB顯色試劑盒，購于北京康為世紀生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購于愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1 3 引物設計與合成

根據GenBank中發表的DHAV-1 SH株病毒基因組序列，設計 3C 基因序列的1對引物，引物序列為：F：5′-TTAGGATCCAGCGGGCGGGTGAATTTCA-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點）、R：5′-GACGAGCTCTTGGTTAAAAACTGGAAAA-ACC-3′（下劃線為SacⅠ酶切位點），由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。

1 4 DHAV-1的增殖與病毒RNA提取

取10倍稀釋的原代病毒0 2 mL接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，于37 ℃孵化箱孵化；選48～72 h死亡雞胚，4 ℃ 過夜，收集尿囊液；參照說明書按Trizol法抽提尿囊液總RNA。

1 5 DHAV-1 3C 基因的擴增和測序

根據RT-PCR試劑盒說明書操作，反應程序：25 ℃ 10 min； 42 ℃ 90 min；70 ℃，10 min。 PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR產物進行0 8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1 6 重組質粒載體pET-3C的構建

PCR 產物經0 8%瓊脂糖凝膠電泳分離回收純化，經BamHⅠ、SacⅠ酶切，與經同樣酶切的pET-32a連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上37 ℃培養過夜；挑取單菌落，提取質粒電泳篩選，進行酶切鑒定，并送由上海英濰捷基生物技術有限公司測序，正確的克隆命名為pET-3C。

1 7 重組菌的誘導表達

將重組質粒pET-3C轉化至BL21（DE3），挑取單菌落接種于5 mL含Amp抗性的 LB 液體培養基中，37 ℃ 振蕩培養過夜；按 1% 接種量轉接至含Amp的5 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養，菌液D600 nm值達 0 4～1 0時，加入0 2～1 0 mmol/L IPTG，37 ℃誘導3～5 h；離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，離心后分別收集上清及沉淀， -20 ℃ 保存備用。相同條件下誘導含表達質粒 pET-32a 的空載體及未加誘導劑的受體菌作為空白和陰性對照。

1 8 表達產物的檢測

取200 μL經誘導的菌液，與50 μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，沸水煮沸3 min，SDS-PAGE凝膠電泳分析。將誘導樣品和非誘導樣品進行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，以鼠抗His單抗作為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進行顯色。

1 9 重組蛋白抗血清的制備

將重組蛋白經SDS-PAGE電泳，切出回收目的條帶，加入少量PBS研磨勻漿化；皮下兩點注射法免疫6周齡ICR小鼠，每隔2周免疫1次；4次免疫后第14天采血，分離血清，-80 ℃ 保存備用。

1 10 多抗血清的Western blot 鑒定

將DHAV-Ⅰ SH毒株雞胚尿囊液進行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，以制備的鼠多抗血清作為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進行顯色。以未接種DHAV-1的雞胚尿囊液作為陰性對照。

2 結果與分析

2 1 3C 基因的克隆

以提取的尿囊液總RNA為模板，RT-PCR擴增出約 550 bp 的目的條帶。經BamHⅠ、SacⅠ雙酶切獲得約550、5 900 bp 2個條帶（圖1）；經進一步測序，克隆的 3C 基因序列及閱讀框完全正確。

2 2 重組蛋白的誘導表達與檢測

由圖2可見，IPTG濃度為1 0 mmol/L，37 ℃誘導4～5 h，重組蛋白可得到較高水平表達，并都以包涵體形式存在，重組蛋白相對分子量約為38 ku。由圖3可見，以抗His標簽單抗對重組蛋白進行鑒定，在目的位置出現1條特異條帶。

2 3 多抗血清的Western blot 鑒定

結果表明，獲得的3C蛋白多抗血清不僅能與pET-3C重組菌誘導，發生重組蛋白反應，而且能與DHAV-Ⅰ SH毒株雞胚尿囊液反應，形成3C蛋白大小約為20 ku的條帶（圖4）。

3 討論

鴨甲型肝炎病毒歸屬于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，與其他小核糖核酸病毒一樣，病毒基因組只編碼一個大的開放閱讀框，翻譯形成一多聚蛋白，需進一步剪切加工形成結構蛋白及病毒復制必須的功能蛋白。在鴨肝炎病毒蛋白加工過程中，3C蛋白是唯一起蛋白酶作用的蛋白，它可以將多聚蛋白加工成單個具有獨立功能的病毒蛋白，在病毒復制及衣殼裝配過程中起重要作用。

pET表達系統是目前使用較為廣泛的一種原核表達系統，在誘導狀態下，外源基因可以獲得高效表達，表達量一般可以達到菌體總蛋白的30%以上。表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，方便目的蛋白的純化，其腸激酶酶切位點可切除融合部分，有利于對目的蛋白的研究。本試驗用pET-32a表達系統成功表達了DHAV-1 3C蛋白，采用RT-PCR技術擴增出完整的 3C 基因，經分析該基因長為543 bp，與DHAV-1 SH株序列同源性達100%，SDS-PAGE電泳證明表達的融合蛋白分子量約為38 ku。

盡管pET原核系統表達的外源蛋白缺少翻譯加工功能，但表達產物依舊保持了良好的免疫原性。本試驗利用表達的融合蛋白免 疫小鼠制備了針對重組蛋白的多抗血清，Western- blot分析說明制備的多抗血清可與DHAV-1尿囊液中的3C

蛋白發生特異性反應，制備的多抗血清具有很好的特異性，可作為檢測用抗體進一步用于DHAV-1 3C抗原的檢測及功能研究。

[HS2 3][HT8 5H]參考文獻：

[1] Wang L，Pan M，Fu Y，et al Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J] Virus Genes，2008，37（1）：52-59

[2]Tseng C H，Knowles N J，Tsai H J Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J] Virus Research，2007，123（2）：190-203

[3]Tseng C H，Tsai H J Sequence analysis of a duck picornavirus isolate indicates that it together with porcine enterovirus type 8 and simian picornavirus type 2 should be assigned to a new picornavirus genus[J] Virus Research，2007，129（2）：104-114

[4]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage close to the genus parechovirus in the family Picornaviridae[J] The Journal of General Virology，2006，87（Pt 11）：3307-3316

[5]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al Recent korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J] Archives of Virology，2007，152（11）：2059-2072 [HJ1 45mm]

[6]Ding C Y，Zhang D B Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J] Virology，2007，361（1）：9-17

[7]張艷芳，羅 薇，劉內生，等 鴨肝炎病毒的研究進展[J] 中國畜牧獸醫，2011，38（7）：171-175

[8]Tseng C H，Tsai H J Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J] Virus Research，2007，126（1/2）：19-31

[9]Jin X，Zhang W，Hu X，et al Idetification and molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type 1 in Hubei Province of China[J] Research in Veterinary Science，2008，85（3）：595-598

[10] 施少華，程龍飛，傅光華，等 鴨肝炎病毒新血清型基因組序列分析[J] 微生物學報，2009，49（3）：309-315

[11]Liu G，Wang F，Ni Z，et al Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type 1（DHV-1）isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J] Virus Research，2008，137（1）：137-141