重組豬抑制素的高密度發酵生產條件優化

李輝　翟穎超　施振旦

摘要： 抑制素（INH）是性腺組織分泌的一種糖蛋白，可通過抑制促卵泡素分泌和性腺組織發育，在動物繁殖活動中起著重要的調控作用。通過對INH α亞基免疫，中和動物體內的INH，可解除INH對動物繁殖活動的抑制作用，從而提高動物的繁殖力。為獲得大量重組的INH α亞基蛋白，滿足生產的需要，本研究對發酵罐高密度發酵工藝進行探索，并分別對發酵培養基的類型、乳糖誘導濃度、誘導時間進行優化。結果表明，采用TB培養基發酵至20 h，菌體D600 nm值達到最大，為22 84，菌體總濕質量為25 48 g/L，顯著高于其他2種培養基，綜合比較細菌生長趨勢、菌體總濕質量以及培養基成本等因素，TB培養基較適用于重組INH的發酵罐生產；終濃度為10 g/L的乳糖誘導5 h可達到最高蛋白表達量，占菌體總蛋白的50%以上，發酵結束時D600 nm值達到36，細菌總濕質量達到28 66 g/L。

關鍵詞： 抑制素；高密度發酵；乳糖誘導；發酵罐

中圖分類號： TQ920 6 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0207-04

抑制素（inhibin，INH）是由性腺組織（卵巢、睪丸）分泌的糖蛋白激素，由α、β亞基通過二硫鍵連接形成異源二聚體 [1-2]。其中α亞基為INH獨有，β亞基則與激活素（activin）共用，2個β亞基通過二硫鍵組成同源二聚體，即為activin [2- 3]。INH具有抑制促卵泡素（FSH）分泌的功能 [4]，還具有直接抑制性腺發育及其功能的作用 [5]。因此，主動或被動免疫INH α亞基，中和動物體內INH的生物活性，可促進垂體分泌FSH，解除INH對性腺功能的抑制，最終緩解INH對動物生殖活動的抑制作用，促進動物繁殖活動。前期研究證實，主動或被動免疫INH α亞基可以顯著提高羊、豬、牛、水牛等動物的發情表現、排卵數、卵子質量、受胎率、產仔數 [6-10]。對蛋雞免疫也起到類似作用，主要表現在顯著提高其產蛋率 [11]。對公畜進行INH α亞基免疫同樣會產生積極作用，主要表現在性成熟提前、睪丸質量和體積增加、精子產生量增加和質量提高等 [12- 13]。江蘇省農業科學院動物品種改良和繁育重點實驗室進一步研究發現，免疫INH α亞基對夏季高溫應激導致的母畜乏情和公畜精子質量下降、母畜產后乏情以及提高種畜的使用年限等具有顯著效果 [12]。綜上，筆者認為重組INH在畜牧業生產中具有較廣泛的應用前景，并蘊藏著可觀的商業價值。

目前所用的INH已經由搖瓶培養原核表達的重組INH全面代替成本較高的人工化學合成的INH。但是在實際生產中，搖瓶培養效率太低，不能滿足畜牧業生產中的巨大需求。為提高生產效率，筆者首次引入發酵工業中的高密度發酵（high cell-density fermentation，HCDF）工藝。高密度發酵是應用一定的培養技術和設備來提高菌體生物量和目標產物時空產率的發酵技術。通過優化發酵過程中的多個相關因素，可以提高菌體數量和單細菌內蛋白表達量，最終達到提高目標蛋白產量的目的 [14- 15]。目前，大腸桿菌高密度發酵技術廣泛應用于多種重組蛋白的發酵生產中 [16-21]，并取得了較好效果。然而，當前對于重組豬INH α亞基的大腸桿菌高密度發酵研究較少，無可以直接借鑒的經驗。本研究對發酵培養基類型、乳糖誘導濃度、誘導時間進行探索，旨在為大規模發酵生產提供依據。

1 材料與方法

1 1 菌株、試劑及主要儀器

表達豬INH α亞基的工程菌BL21（DE3）/pRSET-INH菌株由江蘇省農業科學院動物品種改良和繁育重點實驗室構建并保存。胰蛋白胨、酵母粉購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素購自美國Sigma公司，其余試劑均為國產分析純產品。種子培養基為LB，發酵培養基共3種，分別為TB培養基（胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO4 231 g/L，K2HPO4 12 54 g/L，甘油 4 mL/L）、組合培養基[葡萄糖2 g/L，胰蛋白胨 8 g/L，酵母粉 12 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO4 4 g/L，檸檬酸鈉0 5 g/L，FeSO4·7H2O 0 18 g/L，CaCl2·2H2O 0 1 g/L，H3BO3 0 06 g/L，MnSO4 0 12 g/L，CuCl2·2H2O 0 01 g/L， Na2MoO4·2H2O 0 1 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0 2 g/L，ZnCl2· 7H2O 0 02 g/L]、M9培養基（葡萄糖 4 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NH4Cl 1 g/L，CaCl2 002 g/L，NaCl 0 5 g/L，Na2HPO4 12 8 g/L）。 補料培養基含大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏15 g/L，MnSO4 25 mg/L，MgSO4 5 g/L，NH4Cl 15 g/L。種子培養基在使用前加入氨芐青霉素至終濃度為60 g/L。水平恒溫搖床（德國Therma公司）；20 L 全自動發酵罐系統（鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司）；蛋白質垂直電泳系統（北京六一生物科技有限公司）；分光光度計（德國Eppendorf公司）。

1 2 方法

1 2 1 菌種活化及擴大培養 將凍存于-80 ℃的表達菌株劃線接種于LB固體培養基平板上，37 ℃培養1 d，挑取單菌落接種于5 mL LB培養基中，37 ℃ 230 r/min振蕩培養8 h后，按1 ∶ 100的比例接種于LB液體培養基中，繼續振蕩培養10 h作為發酵種子液。

1 2 2 發酵基本條件 發酵罐在使用前按照標準流程（過濾器消毒-部分管路消毒-空罐消毒）進行消毒滅菌處理。向滅菌后的發酵罐加入發酵罐總體積4/5的培養基（即15 L左右，但考慮到實消時會有23 L蒸餾水進入培養基造成培養基稀釋，所以在配制時取15 L的培養基，加入12 L水，使發酵培養基初始濃度略高），并進行實效。實效結束，將培養基溫度降至37 ℃、罐壓降至0 MPa，打開加料口，在火焰下灌入無菌氨芐青霉素至終濃度為600 mg/L，同時按5%接種量接種于發酵培養基中，并添加2%的有機硅消泡劑。關閉加料口開始發酵。發酵時，溫度設定為37 ℃，攪拌速度設定為 200 r/min，罐壓為0 05 MPa，通風控制在11 7 L/min。通過加氨水和稀鹽酸調節發酵培養基的pH值，加入的氨水可以作為氮源供細菌利用。