犬源金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥性

葛愛民

摘要： 對寵物門診分離得到的25株金黃色葡萄球菌進行耐藥性分析與β-內酰胺酶測定，以了解近3年來濰坊地區犬源金黃色葡萄球菌的耐藥性及其是否產生β-內酰胺酶，以期為臨床上致病性金黃色葡萄球菌感染的有效控制提供依據。使用紙片擴散法進行藥敏試驗；使用碘量法、酚紅法測定β-內酰胺酶的產生。25株金黃色葡萄球菌對替考拉寧、利福平、萬古霉素十分敏感，對其他25種藥物呈現一定耐藥性，并對大多數β-內酰胺類抗生素呈現很高的耐藥性。碘量法、酚紅法測得產β-內酰胺酶的菌株分別為18、17株。產β-內酰胺酶的菌株對萬古霉素、利福平、替考拉寧不具有耐藥性，對β-內酰胺類抗生素基本具有耐藥性；不產酶的菌株對β-內酰胺類抗生素的耐藥性低于產酶菌株。可見，β-內酰胺酶的產生是金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類抗生素具有耐藥性的主要原因。

關鍵詞： 犬；金黃色葡萄球菌；耐藥性；β-內酰胺酶

中圖分類號： S858 292 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0219-02

犬源金黃色葡萄球菌感染可導致膿皮病、外耳炎、角膜炎、關節炎、敗血癥等 [1]，是較為常見的寵物犬臨床細菌感染。由于近年來抗生素的過度使用，金黃色葡萄球菌耐藥性的問題始終困擾著臨床用藥。為了解犬源致病性金黃色葡萄球菌在濰坊地區的耐藥特性，對近3年寵物門診分離得到的25株致病性金黃色葡萄球菌進行耐藥性研究，為臨床醫師合理選用抗生素提供依據。

1 材料與方法

1 1 材料

1 1 1 菌種 25株致病性金黃色葡萄球菌分離自山東畜牧獸醫職業學院及周邊寵物門診的犬臨床病例。

1 1 2 試劑 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、淀粉購自北京奧博星生物技術有限公司；常用藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購自西隴化工股份有限公司；酚紅購自天津科密歐化學試劑有限公司；注射用青霉素鈉購自山東魯抗醫藥股份有限公司。按常規方法自制培養基、碘液、酚紅溶液（5 g/L）指示劑、PBS緩沖液。

1 1 3 儀器 電熱恒溫培養箱購自山東濰坊精鷹醫療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋購自江蘇省醫療器械廠；電子萬用爐購自天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫培養振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器購自常州翔天實驗儀器廠。

1 2 方法

1 2 1 金黃色葡萄球菌菌種的制備 配制普通肉湯瓊脂培養基，制作斜面25個，用接種環取已保藏的25株金黃色葡萄球菌分別接種在斜面上，“之”字形劃線，37 ℃培養24～48 h。

1 2 2 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 配制普通肉湯培養基，經高溫滅菌后倒在25支試管中（每支試管約2 mL），待液體冷卻后，用滅菌的接種環在斜面上取少量金黃色葡萄球菌接種至試管內，于搖床中37 ℃培養24 h。

1 2 3 藥敏試驗 吸取100 μL菌液至普通營養瓊脂平板上，將菌液均勻涂抹在培養基表面，每株金黃色葡萄球菌對應4塊平板，用鑷子將藥敏紙片放置于涂抹好菌液的平板上，每塊平板均勻放置7種藥敏紙片，于37 ℃恒溫培養18 h，培養完成后用卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，記錄試驗結果。藥敏試驗判定標準：抑菌圈直徑≥23 mm為高敏，抑菌圈直徑在18～22 mm為敏感，抑菌圈直徑在15～17 mm為中敏，抑菌圈直徑在13～14 mm為低敏，抑菌圈直徑≤12 mm為耐藥。

1 2 4 碘量法檢測β-內酰胺酶的產生 采用點種法將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種于普通肉湯瓊脂培養基（固體）平板（每塊平板點種4株不同的金黃色葡萄球菌），于37 ℃恒溫過夜。將淀粉瓊脂上層培養基分裝于試管中，每支9 mL，置于55 ℃恒溫水浴鍋。將1瓶注射用青霉素鈉（800 000 U）溶于40 mL無菌水中，配成青霉素含量為 20 000 U/mL 的溶液。向每支裝有淀粉瓊脂上層培養基的試管中加入1 mL配好的青霉素溶液，混勻后立即傾注于培養好的平板上，鋪平待凝。吸取碘液鋪滿平板表面，用滴管吸去多余碘液，于37 ℃培養箱中倒置10～15 min后，觀察菌的周圍是否出現無色透明圈，記錄試驗結果。

1 2 5 酚紅法檢測β-內酰胺酶的產生 配制普通肉湯培養基（液體）并分裝于25支試管中，每支試管4 mL。將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種在25支試管中，于搖床中37 ℃恒溫培養24 h。向1瓶注射用青霉素鈉（800 000 U）中加入1 mL配好的酚紅溶液并混勻。用移液槍分別吸取02 mL青霉素酚紅溶液加入每支待測菌液試管中，混勻后于37 ℃恒溫培養10～15 min，觀察溶液是否由紅色變為黃色，記錄試驗結果。

2 結果與分析

2 1 藥敏試驗

25株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗結果顯示，大多數菌株對壯觀霉素、青霉素G、羧芐青霉素耐藥，對萬古霉素、利福平、替考拉寧敏感，對呋喃妥因、克林霉素、紅霉素相對較為敏感，對其他各種藥物均有很大程度的耐藥性（表1）。

2 3 酚紅法檢測β-內酰胺酶的產生

采用酚紅法檢測β-內酰胺酶的產生，溶液由紅色變為黃色則表明有β-內酰胺酶產生。結果顯示，25株金黃色葡萄球菌中有17株可以產生β-內酰胺酶，產酶率為68%（表3）。

2 4 β-內酰胺酶陽性菌株與陰性菌株的耐藥性

結果顯示，β-內酰胺酶陽性菌株對β-內酰胺類抗生素的耐藥性均非常高，陰性菌株對β-內酰胺類抗生素的耐藥性則低一些；對利福平、萬古霉素、替考拉寧耐藥的菌株均產生了β-內酰胺酶（表4）。

3 結論與討論

本試驗的25株金黃色葡萄球菌中，對萬古霉素、利福平、替考拉寧敏感的菌株較多，耐藥率分別為12%、20%、16%，與相關文獻的結論 [2-3]基本一致。除上述3種抗生素外，試驗菌株對呋喃妥因、克林霉素、紅霉素也較為敏感，耐藥率分別為48%、56%、60%，與卞聰等的研究結果 [4]一致。試驗菌株對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類抗生素的耐藥性均很高，這與分離自不同動物和人體的金黃色葡萄球菌的耐藥性研究結果相符。

細菌通過產生β-內酰胺酶來水解抗生素中的β-內酰胺環，使抗生素對細菌失去治療效果，這是細菌產生耐藥性的方式之一。碘量法利用β-內酰胺酶作用于青霉素，產生裂解酸與淀粉競爭游離碘，使藍色的碘-淀粉復合物褪色，碘量法具有操作簡單、反應迅速的優點 [5]。酚紅法也是利用青霉素經β-內酰胺酶的作用產生裂解酸，從而改變pH值，使指示劑的顏色發生變化 [6]。這2種方法均可定性鑒定β-內酰胺酶的存在 [4]，本試驗碘量法中有72%的菌株產生β-內酰胺酶，酚紅法中則有68%的菌株產生β-內酰胺酶，2種方法測得的結果基本相符。由于觀察結果的時間、 加入試劑的時

間、青霉素溶液配制的時間不同，導致指示劑濃度、待測菌液濃度有一定差別，使個別菌株出現不同檢測方法的差異。

試驗結果顯示，采用碘量法和酚紅法測得的產生了β-內酰胺酶的菌株，對β-內酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素均有高度的耐藥性；而藥敏試驗中對β-內酰胺類抗生素具有耐藥性的菌株中，也有部分菌株并未產生β-內酰胺酶。可見，產生β-內酰胺酶是細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主要原因，但造成細菌耐藥性的原因有很多，不單局限于β-內酰胺酶的產生，且試驗中的操作失誤也可能影響試驗結果。試驗結果還表明，產酶菌株對萬古霉素、利福平、替考拉寧的敏感程度很高，不產酶菌株對這3種抗生素完全敏感，且不產酶菌株對利奈唑胺均無耐藥性，這與劉小朵的研究結果 [7]一致。

近年來寵物市場發展迅猛，人們對寵物健康的重視程度非常高，要求門診醫師能夠憑借經驗和實驗室檢測及時解決致病性金黃色葡萄球菌等細菌感染問題；因此，研究細菌的耐藥性對于臨床合理使用抗生素具有重要指導意義。

參考文獻：

[1] 王彤光 寵物疫病與防治技術[M] 北京：化學工業出版社，2011：78

[2]邵士慧，李槿年，王評評，等 豬源致病性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J] 中國微生態學雜志，2010，22（4）：308-311

[3]趙永達，黃顯會 一例犬金黃色葡萄球菌病的診斷及藥敏試驗[J] 中國畜牧獸醫，2010，37（9）：225-226

[4]卞 聰，李 松 215株金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析[J] 現代醫藥衛生，2011，27（20）：3135-3136

[5]陳 號，馬文靜，田晉紅，等 牛奶中非法添加β-內酰胺酶的檢測方法及研究現狀[J] 畜牧與飼料科學，2010，31（1）：67-69

[6]張鑫瀟，謝巖黎，王金水，等 牛乳中β-內酰胺酶的檢測方法研究進展[J] 中國乳品工業，2011，39（2）：45-47

[7]劉小朵 產β-內酰胺酶的金黃色葡萄球菌的耐藥情況分析[J] 內蒙古中醫藥，2013，32（21）：138