精子保存方法在黃顙魚規模化繁殖中的應用

唐忠林　茆健強　周國勤等

摘要： 以受精率為標準，通過黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）繁苗試驗，分析了3種保存液在黃顙魚規模化生產中的應用效果。結果表明，應用黃顙魚精子保存專用液的授精效果較佳，當雌雄配組比例分別為500 ∶ 1、250 ∶ 1、50 ∶ 1時，3組之間的受精率均不存在顯著差異。規模繁殖生產中，授精時間控制在1 5 h內，可將單尾雄魚配組繁殖的雌魚數量提高到300～500尾，有效提升黃顙魚雄魚使用及規模化繁苗效率。

關鍵詞： 黃顙魚；規模化繁殖；受精率；精子保存；受精率

中圖分類號： S961 2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0226-02

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）屬鲇形目鲿科黃顙魚屬，是小型底棲經濟魚類，在我國各大水系均有分布。黃顙魚肉質細嫩、味道鮮美、無肌間刺，深受廣大消費者歡迎。近年來，江蘇省各地區已廣泛開展了黃顙魚池塘養殖，但其種苗規模生產問題未能得到很好解決，主要存在親本量需求大、勞動強度大、雌雄魚發情時間難以同步及需要大量殺雄魚采精等問題 [1-2]。開發應用黃顙魚精子保存技術有助于提高黃顙魚精子利用率，減少雄親魚宰殺量及勞動量，提高繁苗效率，提升經濟效益。有關黃顙魚精子生理特性、保存液配方及保存條件研究已有報道 [3-7]，但有關保存方法在黃顙魚規模化生產中的應用效果研究報道較少。本研究篩選出授精效果較好的精子保存液，確定適宜的雌雄配組比例及繁殖時間，旨在為促進黃顙魚規模化繁殖提供依據。

1 材料與方法

1 1 材料

黃顙魚親本均為江蘇省南京市水產科學研究所黃橋灘苗種繁育場自行培育，黃顙魚雄魚平均規格達0 2 kg，雌魚平均規格達0 1 kg，親魚體表無傷無病，發育情況良好。電子秤，1、5 mL移液槍，著卵網片，玻璃瓶等。

1 2 精子保存液制備

選擇A、B、C 共3種精子保存液 [6-8]。精子保存液A為黃顙魚精子保存專用液：NaCl 7 68 g，KCl 0 22 g，NaHCO3 025 g，NaCO3 0 21 g，葡萄糖2 g/L蒸餾水。精子保存液B為漁用任式液：NaCl 7 8 g，KCl 0 20 g，CaCl2 0 21 g，NaHCO3 0 021 g/L蒸餾水。精子保存液C為生理鹽水：NaCl 7 g/L蒸餾水。

1 3 精子采集與保存

試驗魚捕撈后暫養于水泥池，采精前12 h對雄魚注射促黃體素釋放激素A2（LHRH-A2）、絨促性素（HCG）、馬來酸地歐酮（DOM），以促進精子成熟。采集精子時剖開雄魚腹腔，用鑷子取出精巢（2 mg/尾），去除血絲，在干凈的培養皿中剪碎，紗網過濾，將單尾雄魚的精液收集到各精子保存液中，保存液均為25 mL。整個取精過程在人工授精前0 5 h內快速完成，避免精子與水接觸，常溫下避光保存。

1 4 黃顙魚人工授精

黃顙魚規模化生產過程中，根據不同雌雄配比條件，通過人工授精來驗證3種保存液在2 h內常溫保存的精子授精效果。在人工授精前24 h對雌魚注射漁用HCG、LHRH-A2、DOM混合藥物，以促使其卵子成熟。待90%以上雌魚卵子成熟后（可輕松擠出）進行人工授精，擠壓雌魚的腹部，使魚卵排入無水的不銹鋼盆中，避免魚卵與水接觸。用移液槍取保存的精液，加入0 3%鹽水激活，迅速倒入卵盆中，人工攪拌均勻，使卵子和精子充分結合授精，再將受精卵均勻布置在著卵網片上，在充氣及流水條件下孵化，10 h后觀察并計數受精卵，統計其受精率。

1 5 試驗設計

探討不同保存液配方、不同雌雄配組比例、不同保存時間3個條件對黃顙魚精子保存液的授精效果，對比A、B、C 3種精子保存液授精效果，并確定黃顙魚規模化生產中適宜的雌雄配組授精比例。經測量，單尾雌魚擠出卵的平均質量為13 74 g，試驗過程中采用的卵量均按這一標準執行，各試驗組使用的魚卵量及精液量見表1。

1 6 數據統計

隨機抽取各試驗組布卵網片9片，每片隨機抽取3個約12 cm2的區域，統計其受精率，再計算各組平均值，應用SigmaPlot軟件分析數據差異性。

2 結果與分析

2 1 3種保存液在不同雌雄比例配組中的授精效果

不同配方精子保存液對精子的活力、授精能力都會產生很大影響，并直接影響人工繁殖的受精率。由表2可知，在黃顙魚親本雌雄尾數比為50 ∶ 1條件下，采用精子保存液A、B、C組的人工繁殖受精率差異不顯著，其平均受精率分別為82 7%、84 6%、80 4%。在黃顙魚親本雌雄尾數比為250 ∶ 1條件下，采用精子保存液A、B進行人工繁殖的平均受精率分別為85 3%、82 8%，顯著高于保存液C組，A組與C組及B組與C組之間存在極顯著差異，A組與B組之間不存在顯著差異。由此可知，隨著黃顙魚親本雌雄比例的提高，3種精子保存液在黃顙魚繁殖中的應用效果存在差別，保存液A、B的應用效果明顯好于保存液C，保存液A的應用效果最好。

2 2 保存液A在黃顙魚不同雌雄配組比例下的授精結果

應用保存液A進行全人工繁殖1 5 h，在黃顙魚親魚雌雄尾數比分別為50 ∶ 1、250 ∶ 1、500 ∶ 1條件下，3個比例組之間的受精率不存在顯著差異，平均受精率分別為81 1%、80 2%、78 4%。由此可見，提高雌雄配組授精的比例并未對受精率造成顯著影響，在應用保存液A的情況下，單尾發育良好的黃顙魚雄魚（精巢質量≥2 mg）可與500尾雌魚配組繁殖授精。

2 3 常溫保存條件下受精率隨時間的變化情況

圖1顯示，黃顙魚規模化繁殖過程中，常溫保存條件下，應用保存液A、B黃顙魚受精率在1 5 h 內變化趨勢不明顯，1 5～2 5 h之間均出現明顯的下降趨勢。應用保存液A進行繁殖時，0 5、2 5 h的受精率分別為83 72%、76 63%；應用保存液B進行繁殖時，0 5、2 5 h受精率分別為81 05%、71 67%。

2 4 保存液A在規模化繁殖中的應用效果

黃顙魚規模化繁殖過程中，由于雄魚精巢大小不一，質量一般為1 2～2 6 g，所以親本魚雌雄配組的比例須根據實際情況確定。由表3可知，應用精子保存液A，人工催產黃顙魚.

3 結論與討論

3 1 不同保存液對黃顙魚精子授精效果的影響

研究表明，黃顙魚繁殖過程中，受精率受精子質量、卵子質量、精子與卵子的比例及繁殖環境等因素影響。不同的保存液配方在黃顙魚精子的保存時間、活力及授精效果等方面具有較大差異 [8]。本試驗保存液pH值范圍為6～8，均為由Na、K等鹽類組成的弱酸堿溶液，可保護精子 [8-9]。保存液A與B成分相似，授精效果相近，A液略優于B液。保存液C成分過于簡單，且pH值略偏小，保存后精子活力及數量下降，故在提高雌雄比的情況下，授精效果相對較差。由于不同雌魚之間的卵子質量、數量及成熟程度等均不一致，對人工授精效果影響很大，需要將雌魚所采的卵子充分均勻混合，再分組稱量，保證各試驗組所采用魚卵質量一致。

3 2 不同雌雄配組比例對人工授精效果的影響

由于黃顙魚在人工繁殖中需要殺雄取精，因此在保證受精率的情況下，提高雌雄配組比例可節省親魚資源，有效提高雄魚使用效率及繁苗效率。保存液常溫保存條件下24 h內可使80%以上的黃顙魚精子保持較好的活性 [10]。本試驗結果表明，應用保存液A，將單尾黃顙魚雄魚配組繁殖的雌魚數量從50尾提高到250、500尾，受精率均未出現大幅度下降，且差異性不顯著。由此表明，單尾雄魚的精子經保存液A有效保存后，精子的活力及數量未出現顯著下降，可基本滿足500尾雌魚卵子的授精需要。黃顙魚規模化繁殖過程中，單尾雄魚精巢質量及所含精子數量具有明顯差異，因此當所選雄魚精巢所含精子數量超過本試驗魚精巢（2 mg）的精子數量時，雌雄配組繁殖比例可提高至更高的水平。

3 3 常溫保存條件下時間對人工授精效果的影響

丁淑荃等研究表明，室溫下，黃顙魚精子在保存液中保存4 h后，精子活力仍很強，被激活后幾乎100%精子在作快速運動，授精能力未受到影響 [10]。本試驗應用保存液A、B常溫保存精子，2 5 h內受精率下降，表明保存時間對人工授精的效果造成了一定影響，因而建議單批次繁苗授精時間控制在1 5 h內。本試驗單批次的親本量均在150 kg以上，人工催產時間較長，操作人員較多，導致雌魚性成熟時間不完全一致，人工擠卵過程發現有部分卵過熟的情況，后期更為明顯，這也是造成受精率下降的主要原因。

3 4 精子保存方法的應用

黃顙魚采用常規方法繁殖時，單尾黃顙魚雄魚通常與 15～30 尾配組授精，繁殖成本較高，效率較低 [1-2]。本試驗應用精子保存方法，單尾黃顙魚雄魚配組雌魚質量達32 2 kg， 尾數達320余尾（約0 1 kg/尾），雄魚親本的部分精巢較小，如果全部選用發育較好的雄魚，雌魚數量可提高至500尾以上。本方法大大提升了雄魚的使用效率，節約了雄魚親本資源，同

時減少繁苗勞動量，降低生產成本。

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