金黃色葡萄球菌在蔬菜中生長狀況分析

劉曉慧　郭鳳柳　賈月梅等

摘要： 菠菜是生活中常見的蔬菜，但金黃色葡萄球菌對其污染嚴重，可引起危及生命的敗血癥及嚴重的轉(zhuǎn)移性感染，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素更是穩(wěn)定性極高，對人體健康造成了危害；因此，為了保證人們的食物安全，須從源頭上控制金黃色葡萄球菌對菠菜的污染。參照國際上風(fēng)險評估的經(jīng)驗，采用蒙特卡洛法建立了菠菜中金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測模型：在10 ℃時建立了Linear模型，15、20、25 ℃條件下建立了Gompertz 模型，并且對其二級模型也進行了分析。研究中還從危害特征描述和暴露評估等方面客觀地對菠菜中金黃色葡萄球菌的生長狀況進行了分析，以期為控制金黃色葡萄球菌對人體的危害提供科學(xué)的理論及預(yù)測方法。

關(guān)鍵詞： 菠菜；金黃色葡萄球菌；生長狀況分析

中圖分類號： TS201 3 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0304-04

隨著食品貿(mào)易的日益全球化，食源性疾病和食品污染是一個巨大的、不斷擴大的世界性公共衛(wèi)生問題。金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）廣泛分布于自然界，是引起食品污染和細菌性食物中毒中極為重要的細菌之一，是導(dǎo)致食物污染和中毒的重要致病菌，也是造成人和動物感染的主要病原菌之一 [1]。葡萄球菌腸毒素（Staphyloccocus aureus entertoxine，SE）導(dǎo)致的中毒現(xiàn)象已成為世界性的食品衛(wèi)生問題。由此引起的食物中毒在美國占整個細菌性食物中毒的33%，在加拿大占45%，而在我國占50% [2-3]。2013年于潔報道了一起在山東地區(qū)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件 [4]。近十年來國外發(fā)達國家利用其檢測技術(shù)優(yōu)勢建立嚴格的技術(shù)壁壘，其中包含各類微生物的限量指標(biāo)。而我國菠菜產(chǎn)品具有品種齊全、質(zhì)量好、價格較低的優(yōu)勢，每年速凍菠菜出口到日本2萬t以上，還部分出口到俄羅斯、歐盟等國家和地區(qū)，加工出口前景廣闊。菠菜的生產(chǎn)過程包括菠菜種植、原料選擇、運輸、貯藏、工廠加工等環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都可能受到金黃色葡萄球菌的污染。應(yīng)用食品安全微生物風(fēng)險分析手段對菠菜生產(chǎn)加工過程中感染金黃色葡萄球菌進行風(fēng)險分析，將有利于更好地對菠菜進行安全管理。本研究應(yīng)用食品安全微生物風(fēng)險分析手段對菠菜中金黃色葡萄球菌從危害識別、流行病例、暴露評估和風(fēng)險識別等方面進行分析，為菠菜中的金黃色葡萄球菌風(fēng)險管理提供依據(jù)。

1 危害識別

1992—2010年對13個監(jiān)測地區(qū)食源性疾病暴發(fā)上報資料進行回顧性分析，結(jié)果這十幾年間共上報9 692起食源性疾病暴發(fā)事件，涉及的患者人數(shù)達268 536人。微生物引起的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，分別占41 5%和58 8%。微生物事件中，以副溶血性弧菌為主，其他依次為沙門氏菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及其毒素。按事件發(fā)生數(shù)統(tǒng)計，家庭是食源性疾病暴發(fā)起數(shù)和死亡人數(shù)最多的地方，而集體食堂是患者數(shù)最多的地方，其中引起金黃色葡萄球菌中毒的事件尤其多，這可能與中國人的飲食習(xí)慣有關(guān)，人們在家里用餐的時間多，而在集體食堂發(fā)生一次中毒事件就會牽扯到很多人。在金黃色葡萄球菌中毒事件中，由于新鮮果蔬營養(yǎng)成分豐富，富于微生物生長，而人們在食用過程中沒有洗干凈直接食用或者烹飪不完全都會受到金黃色葡萄球菌及其毒素的危害，甚至發(fā)生中毒。

金黃色葡萄球菌（S aureus）廣泛存在于自然界、空氣、水和土壤中，是革蘭氏陽性球菌中的典型代表。金黃色葡萄球菌在普通培養(yǎng)基上就能生長良好，平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0 5～1 0 mm，顯微鏡下排列成葡萄串狀。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。在20%CO2環(huán)境中，有利于毒素產(chǎn)生。其最低生長溫度為7 ℃，最適生長溫度為35～37 ℃，最高生長溫度為50 ℃，產(chǎn)毒溫度為10～48 ℃，最適為40～45 ℃，最適生長pH值為7 4～7 6。在攝入生長有S aureus 的食物1～6 h后會出現(xiàn)惡心、嘔吐、不同程度的腹部痛性痙攣和腹瀉的癥狀 [5]。S aureus產(chǎn)生的腸毒素還可以引起腸胃炎，因此S aureus被列為世界上引起腸胃炎的禍首之一 [6]。

2 危害特征描述

金黃色葡萄球菌是在人類化膿感染中常見的病原菌，有30%～50%的菌株可以產(chǎn)生腸毒素和外毒素，可引起化膿感染、腸炎、肺炎、心包炎，甚至膿毒癥、敗血癥。如果腸毒素進入人體，可引起急性胃腸炎等，而且使人體對腸毒素更敏感。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。

金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。例如，2004年河北省石家莊市某大學(xué)發(fā)生一起食物中毒事件，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和病原學(xué)鑒定，證實為一起由金黃色葡萄球菌和變形桿菌引起的食物中毒事件；2005年4月浙江省寧波市某校學(xué)生在學(xué)校小賣部就餐，發(fā)生一起食物中毒事件，共4名學(xué)生發(fā)生食物中毒，經(jīng)證實為一起產(chǎn)A型腸毒素金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件；2009年9月廣西柳州地區(qū)民族高中部分師生及周邊居民50多人發(fā)生食物中毒事件，“罪魁禍首”已經(jīng)確定，致病菌為金黃色葡萄球菌；2011年5月8日寧夏永寧縣一場婚宴上數(shù)十名群眾先后出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，疑似食物中毒，經(jīng)鑒定引起這次中毒事件的為紐波特沙門氏菌和金黃色葡萄球菌；2012年3月江蘇省江陰市某中學(xué)食堂發(fā)生一起240人細菌性食物中毒事件，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查分析和實驗室病原菌檢驗，并結(jié)合患者臨床癥狀，證實這是一起由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件；2013年9月26日江蘇省蘇州市食品安全辦公室對市區(qū)市場蔬菜、肉及制品、乳制品、蛋及蛋制品、大米、水果、水產(chǎn)品、熟食鹵菜等33大類進行抽檢，在盒飯、熟食鹵菜中檢出金黃色葡萄球菌。

3 暴露評估

3 1 在種植的環(huán)境下暴露

（1）菠菜種植地以及周邊環(huán)境的污染是引起菠菜種植過程中感染金黃色葡萄球菌的主要原因。環(huán)境的污染主要是指肥料和水源的污染。金黃色葡萄球菌通過污染施肥用的糞便或灌溉用水間接感染菠菜。（2）種植人員患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）等疾病，卻不加注意衛(wèi)生，造成間接感染。（3）菠菜采摘人員在上完廁所后未洗手就去采摘菠菜、雨水將排泄物從飼養(yǎng)動物的農(nóng)場沖到菠菜種植地里等均為金黃色葡萄球菌的繁殖提供了條件。

3 2 在流通過程中的暴露

菠菜在流通過程中主要通過2種渠道進入到消費者手中：（1）菠菜在流通過程中作為原料，從種植區(qū)運送到蔬菜產(chǎn)品加工廠后，沒有立刻進行加工，也沒有放入冷庫低溫冷藏，造成金黃色葡萄球菌繁殖；在工廠中的加工過程是決定菠菜產(chǎn)品質(zhì)量和安全的重要環(huán)節(jié)，工廠內(nèi)部的各環(huán)節(jié)人員健康狀況、環(huán)境衛(wèi)生情況、工藝控制、交叉污染情況等都容易造成菠菜產(chǎn)品受金黃色葡萄球菌的污染；在運輸和銷售過程中包裝不嚴、運輸和銷售人員自身帶菌、運輸車輛和用具被金黃色葡萄球菌污染等均可間接污染蔬菜產(chǎn)品，產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒；在餐館、路邊小吃攤等環(huán)境衛(wèi)生條件差的地方就餐，廚師等接觸到菠菜的人員在烹調(diào)菠菜前，未對手和刀、砧板等用具進行消毒并且制備食物時生熟食品未分開加工，生熟用具也未分開使用；菠菜在烹飪前清洗不干凈或者焯過菠菜的水又作為飲用或烹飪用水，造成金黃色葡萄球菌污染。（2）從種植地采摘的新鮮菠菜未進行任何加工，直接販賣到消費者手中。消費者在烹飪菠菜前，手、菠菜和廚房用具未進行消毒，菠菜在烹飪過程中加熱不完全，手又接觸餐具等造成廚房與就餐區(qū)域被金黃色葡萄球菌污染。

圖1展示了從菠菜生長到最后食用可能會感染S aureu的過程：原料菠菜中的濃度→加工過程中的變化→貯藏過程中的變化→消費的劑量→消費時攝入的劑量。

如表1所示，通過對河北省保定市及周邊地區(qū)的菠菜種植產(chǎn)地、生產(chǎn)加工企業(yè)以及市場、超市等場所采集的325份菠菜樣品，按照國標(biāo)檢驗方法對325份菠菜樣品進行金黃色葡萄球菌檢測，結(jié)果檢出率達16 3%；同時利用mini VIDAS檢測儀對陽性樣品進行腸毒素的檢測，結(jié)果陽性率為56 6%。 鑒于該菌的廣泛存在及傳播可以對菠菜造成污染，因此，將金黃色葡萄球菌確定為菠菜中的特征性致病菌對其進行風(fēng)險評估研究。

3 3 采用蒙特卡洛法建立菠菜中金黃色葡萄球菌的預(yù)測模型

稱取200 g經(jīng)致病菌檢測結(jié)果為陰性的新鮮菠菜分別置于滅菌大燒杯中，接種菌數(shù)為103～104 CFU/mL 的S aureu菌懸液5 mL，充分混合，用滅菌的紗布封口，注意所有的操作在生物安全柜中進行。將盛有樣品的燒杯分別置于4、10、15、20、25 ℃恒溫儲藏，4 ℃條件下每隔24 h檢測1次S aureu的生長情況；10、15、20 ℃條件下每隔12 h檢測1次，25 ℃條件下每隔6 h檢測1次，每條生長曲線至少檢測10個點以上。每個溫度條件下的樣品均做2組平行。

參考GB 4789 10—2010《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》 [7]的方法，采用Baird-Parker平板和3M金黃色葡萄球菌快速測試片分別對在菠菜上生長一定時間的金黃色葡萄球菌進行計數(shù)。并用SN/T 1869—2007《食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》 [8]中的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法代替生化鑒定試驗中的血漿凝固酶試驗。

利用蒙特卡洛法將測定的生長曲線數(shù)據(jù)分別擬合 Gompertz 方程、Logistic 方程、Richards方程和Linear方程建立生長模型。通過對Gompertz、Logistic、Richards、Linear這4種模型的標(biāo)準差s和相關(guān)系數(shù)r比較，確定最適模型；再由最適生長模型計算出金黃色葡萄球菌的生長參數(shù) [9-11]。

將模擬的4 種模型的標(biāo)準差（s）和相關(guān)系數(shù)（r） 進行比較，10 ℃時Linear模型的標(biāo)準差最小、相關(guān)系數(shù)最大，擬合性也較其他3個模型好，這是因為在低溫條件下微生物生長緩慢。15、20、25 ℃條件下 Gompertz 模型的標(biāo)準差最小、相關(guān)系數(shù)最大，擬合性也最好，其次是Logistic模型，而Linear模型的擬合性最差。由此說明，在溫度較低的情況下應(yīng)該選擇 Linear 模型進行擬合。隨著溫度的升高，遲滯期（Lag）變短，最大生長速率（μmax） 變大，因此加工企業(yè)可以通過這些生長參數(shù)對整個加工流程的時間進行控制，降低金黃色葡萄球菌對食品造成污染的概率。4 ℃時，金黃色葡萄球菌幾乎不生長，不能進行擬合。

Gompertz方程的數(shù)學(xué)描述為：

L（t）=A+Cexp{-exp[-B（t-M）]}。

式中：L（t）為菌數(shù)自然對數(shù)值（ln CFU/g）；A為初始菌數(shù)自然對數(shù)值（ln CFU/g）；C為細菌最大生長量自然對數(shù)值（ln CFU/g）；M為細菌生長率最大時對應(yīng)時間（h）；t為時間（h）；B為M時刻生長率自然對數(shù)值[ln CFU/（g·h）]。

Linear方程的數(shù)學(xué)描述：

y=μmaxt 。

其中，t為時間（h）；μmax為微生物生長的最大比生長速率（h -1）。

通過最適生長模型計算出金黃色葡萄球菌的遲滯期（M）、最大生長速率（B）以及相對最大細菌濃度（A）。由表3可以看出，隨著貯藏溫度的升高，B逐漸增加，而M則逐漸減小。

對于二級模型的建立，這里采用二級響應(yīng)面方程（多項式[CM（25]方程），以自然對數(shù)的方式進行結(jié)合。應(yīng)用二級響應(yīng)面方程，對一級模型中參數(shù)B和M的對數(shù)形式建立二級模型，形式如下（圖2、圖3）：

lnB=6 106+1 178x+1 780x2（r=0 999）；

lnM=2 990-4 403x+8 690x2（r=0 996）。

由圖2和圖3可以看出，隨著溫度的升高，一級模型中生長速率逐漸增大，但是增長的幅度慢慢減小；遲滯期M逐漸減小，證明達到最大生長速率的時間逐漸縮短，降幅也逐漸變小。

4 風(fēng)險特征描述

菠菜含有豐富的維生素A、維生素C及礦物質(zhì)，尤其維生素A、維生素C含量是所有蔬菜類之冠，人體造血物質(zhì)鐵的含量也比其他蔬菜多，對于胃腸障礙、便秘、痛風(fēng)、皮膚病、各種神經(jīng)疾病、貧血有特殊食療效果，對解酒毒及防止齒槽膿漏現(xiàn)象亦具有食療效果。本研究采集了各種可能的食用菠菜樣品，進行了感染S aureus的比例檢測，結(jié)果表明市場上還是流通著很多感染S aureus的蔬菜，下面就上述的危害識別、暴露評估等分析菠菜中S aureus的風(fēng)險特征。

金黃色葡萄球菌是抵抗力最強的無芽胞菌之一，在環(huán)境中廣泛分布，是人類的正常菌叢成分，有時附著于皮膚，特別是寄居鼻腔，成為住院病人發(fā)生感染的顯著危險因素，是常見的化膿性球菌，寄生在大多數(shù)人的皮膚上，常引起皮膚、軟組織感染，細菌可侵入淋巴管及血液，引起危及生命的敗血癥及嚴重的轉(zhuǎn)移性感染如心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、肺炎、腦膜炎等。某些金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生毒素，引起皮疹或多系統(tǒng)功能障礙，如中毒性休克綜合征。根據(jù)上述的預(yù)測模型預(yù)測菠菜在不同溫度環(huán)境下S aureus菌的增長系數(shù)，從而估計菌量，減少食用量，達到預(yù)防S aureus菌及其毒素對身體影響的目的。金黃色葡萄球菌的易感人群主要是有創(chuàng)口的外科病人、嚴重?zé)齻颊摺⑿律鷥骸⒗夏耆恕⒚庖呷毕菡摺⒀翰　盒阅[瘤及糖尿病患者，或患流感、麻疹伴肺部病變者；病后免疫力不強，可反復(fù)感染；其中31～40歲感染率最高，其次是21～30歲年齡段，而男性的感染率要高于女性。

通過HACCP風(fēng)險分析研究后發(fā)現(xiàn)，若在菠菜的種植、加工、銷售和食用中監(jiān)管不嚴或處理不當(dāng)，就會導(dǎo)致感染金黃色葡萄球菌的幾率增大。直接食用的菠菜應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，冷藏或通風(fēng)陰涼的地方放置菠菜也不能超過6 h，在食用前要徹底加熱。在菠菜加工過程中要定期對其生產(chǎn)加工人員進行健康檢查，患金黃色葡萄球菌疑似癥狀的人員要調(diào)換崗位或暫時停止其工作。在整個過程中，如果不能對菠菜的質(zhì)量安全進行控制，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素，雖然徹底蒸煮會殺滅金黃色葡萄球菌，但由于腸毒素的耐高溫性，食用后仍會發(fā)生金黃色葡萄球菌中毒的情況。此外，無論冷凍菠菜的生產(chǎn)過程如何，菠菜中S aureus的初始濃度也是引起風(fēng)險的最根本因素和敏感性分析中很大的風(fēng)險因素，因此從源頭上控制該菌的初始濃度是最為有效的預(yù)防措施。

參考文獻：

[1] 李文杰，黃 和，傅洪銳，等 模擬蟹肉中金黃色葡萄球菌生長模型的建立[J] 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（12）：10-12，17

[2]閆 軍，遇曉杰，蘇 華，等 原料乳中金黃色葡萄球菌風(fēng)險評估基礎(chǔ)研究[J] 中國公共衛(wèi)生管理，2010，26（1）：39-40

[3]Hill W E Chapter 24：Identification of foodbome bacterial pathogens by gene probes[M/OL]//FDA-CFSAN Bacteriological analytical manual [2014-07-15] http：//www fda gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm2006949 htm

[4]于 潔 一起由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒[J] 中國傷殘醫(yī)學(xué)，2013，21（8）：436-437

[5]Stewart C M Staphylococcus aureus and Staphylococcal enterotoxins，in foodborne microorganisms of public health significance[M] 6th ed AIFST（NSW）Branch Sydney，2003：359-380

[6] Doyle M P，Beuchat L R，Montville T J Food microbiology：fundamentals and frontiers[M] Washington DC：ASW Press，1997：524-535

[7] GB 4789 10—2010 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗[S]

[8] SN/T 1869—2007 食品中多種致病菌快速檢測方法 PCR法[S]

[9]Trautmann M，Lepper P M，Schmitz F J Three cases of bacterial meningitis after spinal and epidural anesthesia[J] European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases，2002，21（1）：43-45

[10] Atanassova V，Meindl A，Ring C Prevalence of staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham-a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR[J] International Journal of Food Microbiology，2001，68（1/2）：105-113

[11]閆 軍，許曉曦，湯 巖 原料乳中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型的研究[J] 中國乳品工業(yè)，2008，36（11）：11-13