鉛脅迫對日本免疫相關指標及組織蓄積的影響

唐瑤　杜丹丹　彭東生等

摘要： 將日本[XCZ67 tif，JZ]暴露于不同濃度（0、0 025、0 05、0 5、1 0、2 5、5 0 mg/L）醋酸鉛中，于處理后0、1、3、5、7、10、15、30 d 取血，測定其血清中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性及過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛含量；并于脅迫30 d測定鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢中的鉛含量，以研究鉛脅迫對日本[XCZ67 tif，JZ]免疫能力及組織蓄積的影響。結果表明，在鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均呈先增強后減弱趨勢，且中高濃度鉛脅迫對抗氧化酶活性的誘導速度比低濃度快。脅迫30 d，除0 025 mg/L組外，各試驗組2種酶活性均顯著弱于對照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負相關（P<0 05）。0 025 mg/L組丙二醛含量無明顯變化，其他各試驗組丙二醛含量呈2種變化趨勢，即0 05、0 5、1 0 mg/L組先升后降再升，2 5、5 0 mg/L組持續(xù)上升。脅迫15 d，除0 025 mg/L組外，各試驗組丙二醛含量均顯著高于對照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關（P<0 05）。鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累以鰓和肝胰腺較多，而卵和肌肉在5 0 mg/L鉛脅迫下仍僅有微量蓄積。鰓和肝胰腺中鉛含量與脅迫濃度之間存在顯著濃度效應（P<0 05）。可將日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鰓、肝胰腺鉛含量的長期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測指標。

關鍵詞： 鉛脅迫；日本[XCZ67 tif，JZ]；免疫指標；組織蓄積

中圖分類號： X171 5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0336-04

近年來，由于工農(nóng)業(yè)廢水的大量排放導致的重金屬污染問題日益突出，對生態(tài)環(huán)境安全、人類食品安全及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構成了較大威脅 [1-3]。鉛是常見的重金屬污染元素之一，其在人和動物體內(nèi)長期蓄積會引起慢性中毒、神經(jīng)機能紊亂、貧血甚至誘發(fā)癌癥 [4]。日本[XCZ67 tif，JZ]（Charybdis japonica）廣泛分布于我國各海區(qū)，營底棲生活，為經(jīng)濟價值較高的海水養(yǎng)殖蟹類 [5]。關于重金屬對日本[XCZ67 tif，JZ]的影響已有少量研究報道，如張紅霞等分析了重金屬離子對日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響 [6]；王春琳等探討了硫酸銅蓄積對日本[XCZ67 tif，JZ]保護酶系統(tǒng)的影響 [7]；苗利軍等對秦皇島海域野生日本[XCZ67 tif，JZ]等9種海產(chǎn)品總汞含量進行了檢測 [8]。本試驗研究了不同濃度鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性以及脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)物——丙二醛含量的變化，并分析了主要器官中鉛的蓄積量，旨在探討鉛對日本[XCZ67 tif，JZ]的毒性作用，為養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控、海洋環(huán)境監(jiān)測及相關毒理學研究提供參考。

1 材料與方法

1 1 試驗材料

日本[XCZ67 tif，JZ]于2013年10月購自江蘇省連云港市高公島海濱，采用生態(tài)閉路循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)條件為：鹽度2 5%，pH值8 0，水溫15 ℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次鮮活貝類。選擇附肢完整、活性強者用于試驗，甲長為（516±0 28） cm，甲寬為（6 82±0 41） cm，體質(zhì)量為（7659±1764） g。

1 2 試驗設計

鉛源采用醋酸鉛，為國產(chǎn)分析純。根據(jù)GB 11607—1989《漁業(yè) 水質(zhì)標準》 （鉛濃度≤0 05 mg/L）以及海水通常的鉛污染濃度 [9]，醋酸鉛濃度設7組：對照組（0 ）、低濃度組（0 025、0 05 mg/L）、中濃度組（0 5、1 0 mg/L）和高濃度組（2 5、5 0 mg/L），每組設3個平行，每個平行隨機取27只蟹，飼養(yǎng)30 d。水溫、投餌、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同，每天定時換水2次，每次更換水體的50%，并維持各組醋酸鉛質(zhì)量濃度。

1 3 試驗方法

于試驗后0、1、3、5、7、10、15、30 d隨機抽取3只/缸蟹采集血樣。用無菌注射器先吸取ACD抗凝劑 [10]1 mL，再由蟹第三步足基關節(jié)處按1 ∶ 1比例抽取血淋巴，充分混勻， 5 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液即為血清，-80 ℃冷凍保存。30 d采集血樣后，分別將各組標本冰凍麻醉后置冰盤上解剖，取出肝胰腺、肌肉、卵巢、鰓，用預冷重蒸水（0～4 ℃）沖洗，濾紙吸干水分，-80 ℃保存。

超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性、丙二醛含量和酶液蛋白含量采用南京建成生化試劑盒及美國BioTek Snergy HT型酶標儀測定。樣品中鉛含量采用日本島津AA6300型原子吸收分光光度計測定。

1 4 數(shù)據(jù)分析

所測數(shù)據(jù)采用SPSS 16 0軟件進行統(tǒng)計分析，進行單因子方差分析（One-Way ANOVA），LSD多重比較和Duncans檢驗，顯著水平設為α=0 05。

2 結果與分析

2 1 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性的影響

由圖1可見，在鉛脅迫下，各試驗組超氧化物歧化酶活性均呈先增強后減弱趨勢。脅迫1 d時，除0 025 mg/L組外，各試驗組超氧化物歧化酶活性均受到顯著誘導（P<0 05），其中以1 0、2 5 mg/L脅迫對超氧化物歧化酶活性的誘導效果較強。在低濃度組（0 025、0 05 mg/L），超氧化物歧化酶活性隨脅迫時間延長而增強，分別于處理后10 d和7 d達到最高，隨后呈減弱趨勢。中濃度組（0 5、1 0 mg/L）和高濃度組（2 5、5 0 mg/L）超氧化物歧化酶活性最高值分別出現(xiàn)于 處理后5、3 d，其后持續(xù)減弱。至脅迫后15 d，濃度≤1 0 mg/L 的試驗組超氧化物歧化酶活性仍顯著強于對照組，而高濃度組活性顯著減弱。脅迫30 d時，除0 025 mg/L組外，各試驗組超氧化物歧化酶活性均顯著弱于對照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負相關（r=-0 932，P<0 05）。endprint

2 2 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]過氧化氫酶活性的影響

脅迫1 d時，除0 025 mg/L組外，各試驗組過氧化氫酶活性均顯著強于對照組（P<0 05），脅迫質(zhì)量濃度≥1 0 mg/L 各組增強幅度較大（圖2）。≥1 0 mg/L各組過氧化氫酶活性于5 d時增至最強，隨后持續(xù)減弱。而低濃度組（0 025、0 05 mg/L）對過氧化氫酶活性誘導較慢，最高值分別出現(xiàn)于脅迫后10、7 d。脅迫30 d時，除0 025 mg/L組外，各試驗組過氧化氫酶活性均顯著弱于對照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負相關（r=-0 920，P<0 05）。

2 3 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]丙二醛含量的影響

如圖3所示，除0 025 mg/L組丙二醛含量無顯著變化外，各試驗組丙二醛含量呈2種變化趨勢：0 05、0 5、1 0 mg/L 組丙二醛含量先增強后減弱再增強，而高濃度2 5、5 0 mg/L）組丙二醛含量表現(xiàn)為持續(xù)上升。脅迫1 d，≥0 5 mg/L組丙二醛含量顯著高于對照組（P<0 05），以1 0 mg/L組上升幅度最大。0 05、0 5、1 0 mg/L組丙二醛含量于脅迫7 d時有所下降，隨后又持續(xù)上升。脅迫15 d時，除0 025 mg/L組外，各試驗組丙二醛含量均顯著高于對照組（P<0 05），且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關（r=0 918，P<0 05）。隨著脅迫時間的延長，各試驗組間丙二醛含量的差距逐漸增大，但組間規(guī)律未變。

2 4 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]組織蓄積量的影響

從表1可以看出，鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累以鰓最多，肝胰腺次之，而卵和肌肉即使在5 0 mg/L鉛脅迫下僅有微量的蓄積。對照組在未添加外源性鉛脅迫的條件下，仍能檢測出微量鉛。鰓和肝胰腺中鉛含量與脅迫濃度之間均存在顯著的濃度效應（P<0 05）。

3 結論與討論

3 1 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]免疫指標的影響

鉛是一種不能降解且廣泛存在的重金屬污染物，其在生物體內(nèi)的富集會嚴重損害機體的免疫防御系統(tǒng)，導致抗病力下降甚至死亡 [11-12]。當生物體受到鉛等重金屬污染物時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ O-2[KG- 2]· ），造成機體的氧化損傷如酶蛋白失活、DNA斷裂等 [13]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是防御系統(tǒng)的關鍵酶，可聯(lián)合清除活性氧自由基，防止過多的活性氧積存對機體造成氧化損傷 [14]。目前對抗氧化酶作為生物體氧化脅迫和損傷的標志物已進行了大量研究，但大多集中于銅、鋅、鎘等重金屬 [15-16]，而關于鉛對海洋動物免疫相關酶影響的報道相對較少。任虹等研究發(fā)現(xiàn) 5 0×10 -17～50×10 -10 mol/L鉛對扁玉螺（Neverita didyma）過氧化氫酶有微弱的激活作用 [17]。王凡等報道鉛脅迫下，牙鲆（Paralichthys olivaceus）過氧化氫酶活性變化表現(xiàn)為先抑制后增強再抑制 [18]。張紅霞等研究表明，鉛脅迫0 25 d時，日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶活性呈顯著激活狀態(tài)，隨著脅迫時間的延長逐漸減弱，鉛濃度≥2 5 mg/L試驗組9 d后超氧化物歧化酶活性均顯著弱于對照組，但未檢出過氧化氫酶活性 [6]。本試驗結果表明，鉛脅迫對日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出明顯的“短期誘導、長期抑制”的效應，且高濃度（≥2 5 mg/L）鉛的誘導作用在脅迫早期迅速出現(xiàn)，低濃度（≤0 05 mg/L）鉛的誘導則需要相對較長的暴露時間。鉛脅迫30 d，鉛濃度≥0 05 mg/L組2種酶活性均顯著弱于對照組，表明鉛的長期脅迫使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力下降。

丙二醛是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的重要產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間交聯(lián)而導致細胞損傷 [19]。Company等研究發(fā)現(xiàn)，貽貝（Bathymodiolus azoricus）暴露在0 9 μmol/L 鎘溶液里24 h后，鰓中丙二醛含量顯著升高 [15]。本試驗中，鉛濃度≤1 0 mg/L組丙二醛含量先升后降再升，而高濃度脅迫組丙二醛含量持續(xù)上升，表明一定程度的鉛脅迫可使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力提高，減少丙二醛的產(chǎn)生，而低濃度鉛長期脅迫或高濃度短期脅迫會破壞抗氧化系統(tǒng)，導致機體清除自由基能力降低，過多的活性氧使脂質(zhì)過氧化程度加劇，丙二醛含量隨之增加。

本研究中，鉛脅迫30 d的日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負相關，以前者相關系數(shù)較大，且過氧化氫酶活性對鉛脅迫的響應比超氧化物歧化酶活性略有滯后，而脅迫15 d的丙二醛含量即與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關，可將日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的長期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測指標。

3 2 鉛脅迫對日本[XCZ68 tif，JZ]組織蓄積的影響

與銅、鎘等重金屬相比，鉛更易被某些海洋生物所累積，成為當前威脅海洋食品安全的主要因素之一 [20]。本研究中的對照組在未添加外源性鉛脅迫的條件下，仍檢測出微量鉛，其中鰓和肝胰腺中的鉛含量超過或接近GB 2762—2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》標準（0 5 mg/kg）。

趙元鳳等將牙鲆暴露于鉛環(huán)境中，其體內(nèi)鉛的蓄積量從多到少依次為內(nèi)臟>鰓>肌肉 [21]；而王凡等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過鉛脅迫處理后的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）體內(nèi)的鉛蓄積量從多到少依次為鰓>內(nèi)臟>肌肉 [22]。本試驗中，鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累規(guī)律與櫛孔扇貝一致。鰓作為呼吸器官，與水體直接接觸，鉛較易進入鰓上皮中，造成鰓中鉛含量迅速上升；而肝胰腺為重要的消化腺，積極地進行營養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝，同時也較易蓄積外源性重金屬。王蘭等以體腔注射法對中華絨螯蟹（Eriocheir siensises）給予鎘脅迫，1 周后鎘主要積累在肝胰腺和鰓中，而卵巢與肌肉幾乎沒有積累。其所采用的體腔注射法，使鰓未與鎘直接接觸，所以試驗結果中肝胰腺的鎘含量多于鰓 [23]。本研究發(fā)現(xiàn)，即使在高濃度鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]卵和肌肉中仍僅有微量的蓄積，與前者報道規(guī)律相近。endprint

從本試驗結果綜合來看，在GB 11607—1989《國家漁業(yè)水質(zhì)標準》上限水體（鉛濃度0 05 mg/L）中，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性明顯減弱，且鰓和肝胰腺鉛含量超過了GB 2762—2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》標準，這在養(yǎng)殖生產(chǎn)及水產(chǎn)品食用安全中不容忽視。高濃度鉛脅迫會造成日本[XCZ67 tif，JZ]免疫酶活性大幅減弱，可能會導致養(yǎng)殖蟹的疾病暴發(fā)。可將日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鰓、肝胰腺鉛含量的長期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測指標。

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