氧化銅納米顆粒的環境影響及其生態毒理效應綜述

付昕　葛泰根　朱方等

摘要： 隨著納米科技的迅猛發展，多種納米材料被廣泛應用并逐步進入到周圍的環境及生命體中，納米材料的生物安全性和生態毒理學效應逐漸成為國內外關注的熱點。納米氧化銅（CuO）因具有良好的殺菌性、催化特性、熱穩定性而被廣泛應用于涂料、廢水處理、殺菌、生物醫用陶瓷材料等領域，因此它將不可避免地進入環境和生態系統中，并引起相應的環境毒理效應。本文從流行病學調查和試驗研究2個方面出發，綜述了納米CuO對細胞（細胞膜、細胞生長、凋亡）、生物體（肺、肝、腎）、生態系統的影響，探討其產生毒性的可能機制，并對其毒性研究的前景進行展望。

關鍵詞： 納米氧化銅；環境健康；生態毒理；細胞；生物體；綜述

中圖分類號： TQ131 2+1；X171 5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0340-04

伴隨著納米科技的快速興起與發展，在20世紀80年代末、90年代初期，種類繁多的納米科技產品迅速走進了人們的視野。科學家們對納米技術的發展作了預言：納米科技的發展將會給社會帶來非常大的經濟利益，能夠促進先進材料的制造、新型能源的開發、生物技術的發展、疾病的診斷和治療等 [1]。納米材料由于尺寸較小、化學組成與結構的特殊性，以及不同于以往傳統材料的特殊物理化學特性（如小尺寸效應、大比表面積、高表面界面效應、高量子尺寸效應、高量子隧道效應等），目前已經被廣泛應用于醫藥、電子、能源、環保、通訊、化妝品、航空航天、材料等領域。納米材料在生活、工作中的廣泛運用，使得人類與其接觸的機會大大增加，因此納米材料逐步滲透到人類的生存環境和生態系統中。由于納米材料本身所具有的特殊性，它們易于與生物體的細胞器、細胞、組織器官，甚至是蛋白質這類大分子物質等相互作用，可能造成細胞以及組織器官的功能異化，從而給生物體的健康帶來諸多影響。因此，納米材料是否會給人們的生活工作環境帶來污染、是否會對生物體的健康帶來影響、是否會造成生態環境的破壞這一系列問題引起了各國研究者及政府部門的廣泛關注 [2-4]，對納米材料的生物安全性進行評價已成為當務之急。目前廣泛應用的納米材料主要有以下幾大類：碳納米管（CNTs）、富勒烯（fullerene）、量子點（QDs）、金屬氧化物（氧化鐵、二氧化鈦、氧化銅）等 [5]，其中納米氧化銅（CuO）是應用最廣泛的納米材料之一。易于形成片狀結構，較薄的納米片向各個方向生長，經纏繞交織而形成花狀、蒲公英狀、管狀、傘狀、線狀、棒狀等結構。由于具有良好的催化活性、熱傳導性及氣敏性，目前納米CuO已被大量開發生產，廣泛用于電池、太陽能轉換、氣體傳感器、微電子、傳導液、殺菌、新型的催化劑（取代貴金屬）、化妝品等與人們生產生活息息相關的行業中。納米CuO被認為是在21世紀應用最廣泛的新材料、新產品，下面簡要介紹納米CuO在相關行業中的應用。

1 1 新型催化劑

在有機化學反應中，納米CuO是最為廣泛使用的催化劑。甲醇作為新興的生物質能源，是當今的研究熱點，為了實現其能源的快速完全轉化，有利于促進能量的完全釋放，將納米CuO加入到甲醇的氧化反應中。在納米CuO的催化作用下，甲醇在210～220 ℃時的轉化效率達到90%，遠高于添加其他納米材料。

在生物科技領域，納米CuO可催化氨基酸并使其發光，實現對氨基酸的檢測。有研究者利用低溫固相法所制得的納米CuO來催化精氨酸天冬氨酸的魯米洛化學發光體系，經過對比發現，相對于分析純CuO、Cu 2+，納米CuO的催化活性分別提高了5 65、4 51倍 [6]。此外，在檢測氨基酸方面，納米CuO也表現出了較高靈敏度，可作為氨基酸檢測的新型方法。

1 2 殺菌作用

目前被采用的抗菌劑大部分為光催化類抗菌劑，這種抗菌劑多數是屬于寬禁帶的n型半導體氧化物，半導體的能帶結構通常是由1個充滿電子的低能價帶（valenee band，VB）和空的高能導帶（conduetion band，CB）構成，二者之間存在禁帶。當能量大于或等于半導體帶隙能的光波輻射時，處于價帶的電子（e-）就會被激發到導帶上，價帶生成空穴（h+），從而在半導體表面產生了具有高度活性的空穴電子對，并與環境中的O2、H2O 發生作用，細胞中的有機物分子與產生的活性氧自由基發生化學反應，從而達到殺菌的目的 [7]。CuO屬于p-型半導體，自身存在空穴（CuO）+，可能與環境發生作用而起到抗菌或抑菌的作用。Mahapatra等采用液相法，Cu（OH）2 前驅體以堿式 CuCO3、NaOH為原料所獲得，然后將其熱分解得到納米CuO，研究結果表明，納米CuO對肺炎桿菌、綠膿桿菌有良好的抑菌作用 [8]。

1 3 傳感器的應用

物理傳感器、化學傳感器是現階段最主要的2類傳感器。物理傳感器是以外界的熱、光、磁、溫度、濕度等物理量為對象，將檢出物理量轉變成電信號的裝置。化學傳感器則是把特定化學物質的種類和濃度轉化成電信號的裝置，將敏感材料與待測物質的分子、離子等相互接觸，根據電信號的變化來開發化學傳感器。因此傳感器能較為靈敏地反映外界環境中某些物質的變化，廣泛應用于環境檢測、氣象預報、醫療診斷等方面。半導體金屬氧化物CuO可作為還原性氣體（CO、H2、CH4）和氧化性氣體（NOx）檢測的靈敏材料 [9]。此外，納米CuO具有高比表面積、高表面活性、特異物性、小尺寸性等一系列特點，加上對于外界環境變化如溫度、光、濕度等方面的靈敏反應，因此將納米CuO包裹在其他材料的表面，將大大提高傳感器對CO、乙醇的選擇性，為檢測環境質量提供了更為靈敏及先進的方法 [10-12]。

1 4 與其他材料復合

復合納米材料由于具有單一納米材料所不具備的特點而受到人們的普遍關注，納米CuO與其他材料復合而形成的復合材料具有良好的物理特性。

作為催化劑，納米CuO的催化活性點很低，而與其他材料復合后，例如CuO/CeO2在160 ℃且存在H2的情況下，CO有很高的催化活性和選擇性，其催化活性遠高于相同條件下制備的Co/Mn [13]。納米CuO與其他材料所得的復合材料不僅可以作為CO與氮氧化物的氧化、還原催化劑，還可充當揮發性有機氣體、甲烷燃燒的催化劑。在復合材料中添加適量的CuO，可以提高甲烷的起始燃燒溫度達到350 ℃，完全燃燒溫度達到630 ℃，使用這種復合材料將會大大提高染料的燃燒率，從而節省能源。此外復合納米材料具有一定的熱穩定性，當焙燒溫度達到800 ℃，復合材料仍具有較好的催化活性 [14]。白守禮等通過合成3種不同CuO復合材料，分別為CuO/Al2O3、CuO/CeO2、CuO/SiO2，對比這3種復合材料的氣敏活性結果表明，復合氧化物的比表面積對CO、H2的靈敏度都顯著提高，這可能是由納米氧化復合物之間的電子相互作用和化學疊加效應所造成的 [15]。endprint

2 納米CuO的安全性研究

由于納米CuO在各個領域被廣泛研究和應用，納米CuO逐漸被大量生產，導致越來越多的工作人員、研究人員、生產者、消費者都會無法避免地大量接觸到納米CuO。同時，納米CuO也會伴隨其生產過程，通過大氣、土壤、廢物處理、水體、食物鏈等多種途徑進入環境及生命體中，所產生的環境影響和生態毒理效應引起了廣泛的關注。在目前的研究中，對于納米CuO的安全性依然沒有進行全面的測評，下面將從生物體、生態系統2個方面對其進行測評。

2 1 納米CuO對細胞的影響

由于納米材料具有與生物分子相似的尺寸，當進入生物體后很容易進入到細胞中；因此，小粒徑的納米顆粒不僅易穿透細胞膜，而且不易被巨噬細胞及樹突狀細胞所吞噬，使得其毒性可能會對細胞的生長、代謝甚至 DNA、RNA產生影響。

2 1 1 納米CuO跨膜轉運 細胞膜作為防止細胞外物質自由進入細胞的保護屏障，保證了細胞內環境的相對穩定，使各種生化反應能有序進行。外源物質穿過細胞膜通常有3種途徑：被動運輸、主動運輸、內吞與外排作用。采用透射電子顯微鏡觀察發現，納米CuO能穿過人體肺表皮細胞（A549）而進入細胞內部，在細胞質、溶酶體、線粒體甚至細胞核中都發現有納米CuO的存在 [16-17]。研究者通過透射電子顯微鏡觀察經過納米CuO處理的A549細胞發現，其細胞形態發生了明顯變化，同時由于初級溶酶體過多的蛋白質累積導致次級溶酶體的產生和累積。以上研究結果也間接證明了納米CuO進入細胞可能是通過內吞作用，而并非通過被動擴散作用。

2 1 2 抑制細胞生長 目前對于納米材料的毒性評價主要有2種方式：體內試驗、體外試驗。體內試驗更接近生物真實的暴露情況，而體外試驗主要是納米材料對細胞造成的毒性作用，用細胞存活率、細胞膜完整性通透性的改變、氧化脅迫等指標來進行檢測。細胞存活率是細胞毒性研究最常用的指標，近年來研究者通過體外試驗發現，用納米CuO處理的人體肺表皮細胞（A549）的細胞存活率隨著納米CuO濃度的升高而逐漸降低，呈現明顯的劑量依賴效應。此外，研究者選取了其他納米材料（圓柱形的硅納米顆粒 [18]、殼聚糖納米顆粒 [19]、硅包覆的磁性納米顆粒 [20]）與納米CuO進行毒性對比，發現納米CuO的IC50值遠低于這3種納米材料，說明納米CuO具有更高的毒性，造成這一現象的原因可能有2個：（1）通過電鏡觀察發現納米CuO的粒徑處于20～40 nm，均小于圓柱形的硅納米顆粒[（214±29） nm]、 殼聚糖納米顆粒（>109 nm）、包覆的磁性納米顆粒 （50 nm）；（2）金屬氧化物的納米材料在完全細胞培養液中會釋放出金屬離子，這些金屬離子也會對人體細胞產生毒性作用 [21-23]。

2 1 3 引起細胞凋亡 通過透射電子顯微鏡觀察可發現，納米CuO處理后的細胞體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，此外細胞核核仁消失、凋亡小體可見；進行凝膠電泳檢測發現，DNA出現梯狀的隨機斷裂，這一系列現象說明細胞發生凋亡。為了進一步地驗證納米材料對于細胞凋亡的影響，很多研究者選擇具有代表性的凋亡基因（P53、bax、bcl-2、caspase-3），經過實時熒光定量（quantitative real-time PCR分析發現，經過處理后的細胞凋亡基因的表達量明顯與對照組具有顯著性差異 [24]。這些基因表達量的變化有利地證明了納米CuO引起的細胞凋亡不僅體現在細胞形態的變化上，甚至對基因表達產生了損傷。

2 2 納米CuO對生物體的影響

2 2 1 納米CuO對肺部的損傷 肺臟是環境中有害物質進入人體之后最容易沉積的重要器官，納米顆粒由于粒徑較小，吸入后很容易沉積在肺中，從而引起相應的病理損傷和炎癥反應。國際放射線防護委員會（ICRP）的研究表明，納米顆粒可通過呼吸作用在人類的呼吸道及肺泡中沉積。經研究統計發現，粒徑為1 nm的顆粒90%左右可以在鼻咽部沉積，其余10%沉積在氣管支氣管區；粒徑在5～10 nm的顆粒，沉積在上述3個部分的比例均為20%～30%；粒徑為50 nm的顆粒，約有50%沉積在肺泡中。Ram等采用支氣管注入法將試驗動物成年大鼠暴露于含有納米CuO的環境中，按照大鼠體質量分別以1、5 mg/kg染毒24 h、7 d，結果發現染毒24 h后大鼠肺泡出現急性炎癥反應，同時形成肺大泡、空泡化，表現出肺組織損傷；處理7 d后，肺部出現單核細胞浸潤、肉芽腫、淋巴聚集等現象 [25]。這些結果都表明，納米CuO具有較強的炎癥潛力，同時受損傷的組織會產生不可逆轉的慢性病灶如纖維化、肉芽腫等。納米顆粒通過呼吸作用進入肺泡后，附著在肺泡表面的難溶顆粒有的以主動運輸的方式通過細胞膜進入細胞，以致引起細胞的病變；有的可到達淋巴腺或隨淋巴液循環進入血液，在血液和體液的帶動下，進一步轉運至心臟、肝臟、腎臟，甚至到達中樞神經系統中，引起相應的毒性癥狀，如心血管系統疾病、肝功能失調、腎臟疾病等。

2 2 2 納米CuO在肝、腎中的富集 肝臟作為體內最主要的解毒器官，承擔了分解外來異物的主要功能，隨后在血液的帶動下，將分解后的毒物及雜質輸送到腎臟，經腎小球、腎小管過濾后排出體外，可見肝臟是維持生物體生命活動和新陳代謝穩態的最重要的器官，也是外來異物作用的靶器官。Lei等采用經口一次性染毒的CuO納米顆粒，分別設置50、100、200 mg/kg 3個濃度梯度，5 d后發現大鼠在高濃度組處理下出現體質量下降、嗜睡、低通氣、震顫以及背部拱起等癥狀 [26]。后經臨床生化指標檢測發現，其中天冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶、血漿代謝產物膽紅素明顯高于對照組，這些指標均說明大鼠肝臟已發生病變，引起肝功能損傷。為了進一步驗證，通過病理學觀察發現，大鼠肝臟在高濃度時已經壞死，且肝細胞體積增大，細胞核消失，胞質透明，呈現中央靜脈周圍細胞水樣變性的特征，位于肝門區的大量淋巴細胞浸潤；腎近曲小管壞死，壞死面積已擴展至腎全部，甚至在管腔中發現細胞碎片，可觀察到蛋白質樣物的沉淀。可見腎臟、肝臟是納米CuO在生物體內的重要靶器官。endprint

2 3 納米CuO對生態系統的影響

隨著納米技術的發展，納米材料被普遍生產和研究，同樣也必將在生產、運輸、使用、廢物降解等多個過程中進入大氣、土壤、水體、生物體等組成的整體生態系統中。即便目前對納米材料在這些程序中的儲蓄、釋放程度還不是完全明了，但它們會不斷地通過在整體大的生態系統的各環節中潛在地蓄積，在無生命的空氣和水中逐步積累后，以多種途徑進入生物體，在特定組織（器官）中不斷增加濃度，進而與生物大分子相結合，產生顯著的生物毒性效應。此外，它們還可以通過運動遷移和擴散，實現遠距離輸送傳播，對生態系統中的大范圍的群體或個體生物帶來不同程度的影響。

金盛楊等對土壤生態系統進行研究，選擇了土壤系統氮循環過程中參與其中的土壤脲酶，發現該酶通過專性水解尿素等有機氮源而釋放出銨，從而調節土壤肥力。將土壤加入到1～1 000 mg/kg納米CuO懸液中，在37 ℃黑暗中培養 24 h，在 1～1 000 mg/kg范圍內，納米CuO 對土壤脲酶活性產生了顯著（P<0 05）或極顯著（P<0 01）的抑制效應；在相對低濃度下，納米CuO對土壤脲酶活性具有抑制效果；在相對高濃度下，納米CuO引起了脲酶活性抑制。由此可以推測，納米CuO對土壤酶具有高毒性效應，從而在進入土壤系統后會破壞土壤質量；另一方面，納米CuO釋放出的Cu 2+會富集于農作物當中，進一步進入人體，從而損害人體健康。

Aruoja等研究了納米CuO對水生微型藻（Pseudokirchneriella subcapitata）的影響，發現納米CuO會造成微型藻的死亡，不僅是因為納米CuO釋放出的Cu 2+，導致呈劑量反應關系，而且是由于納米CuO的懸液會聚集成團，使得陽光不能透過，因缺乏陽光而不能進行光合作用并產生營養物質 [28]。

3 納米CuO的毒性作用機制

目前對于納米CuO的生物毒性作用機制尚未完全明了，但是通過國內外研究現狀說明，氧化應激反應及活性氧（ROS）的大量產生可能是最主要的毒性作用機制 [29]。

就材料本身的特性來講，納米材料顆粒擁有較大的比表面積及較小的尺寸。尺寸越小，越易進入機體；而比表面積越大，當與機體接觸時，機體表面的活性點就越多，從而沉積在組織器官內。雖然納米材料的毒性不能僅靠其小尺寸效應來解釋，但可以確定的是：顆粒的尺寸越小，越易沉積于細胞及組織當中而不被巨噬細胞所清除。

納米顆粒的大比表面積和單位質量內較多的粒子數目，使得納米顆粒的表面反應活性成倍增高，遠遠超過常規材料；與常規材料相比，納米顆粒表面更容易產生具有高活性的自由基 [30-31]。自由基能夠誘導細胞的氧化損傷和炎癥反應，激活與免疫相關的一些分子的合成和釋放。此外，納米顆粒的表面基團決定著其電子特性，比如親電子的表面基團可以與分子氧（O2）反應而生成超氧陰離子（ O-2[KG- 2]· ）自由基，進而通過Fenton歧化反應生成 ROS。ROS的產生可以與細胞中的DNA發生作用，進而對DNA造成氧化損傷 [32-34]。根據研究發現，CuO最初暴露于A549細胞時即產生了大量的ROS；隨著處理時間的延長，啟動了細胞內的 p53/p38 基因的表達 [35-36]，其介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用，對受到損傷的DNA進行修復；染毒細胞隨著染毒時間的增加，發生了DNA鏈的斷裂并產生了DNA氧化損傷物（8-OHdG）。以上研究結果均說明，納米CuO產生的生物毒性效應與ROS的產生有一定的關系。

4 結論

納米CuO由于具有良好的催化活性、電學、材料學等方面的性能，在許多領域得到了廣泛應用。目前更多的研究集中在對水生藻類 [37]、細胞 [38-39]等的毒性效應；缺少納米CuO對環境、生態系統群體、個體的生物影響的相關研究。對于納米CuO在生態系統中的釋放過程、運輸模式、降解時間、生物毒性、在生物體內的富集等方面缺乏系統的研究。

目前仍須進一步解釋納米CuO環境健康和生態毒理方面的問題包括以下4個方面：（1）量化納米CuO的生產以及在空氣、土壤、水生態系統中的釋放過程，可為深入徹底地研究納米CuO的在環境中的形態轉換及遷移途徑提供相應的理論基礎；（2）采用慢性毒性試驗以及選擇相應的受試生物，有助于人們全面了解納米材料的潛在危害，為進行環境健康安全暴露評價提供相應依據；（3）研究納米CuO的毒性作用不應僅局限于斑馬魚等模式生物中，更應深入到分子水平，從而從分子及基因水平研究納米CuO的毒性作用機制；（4）制定納米材料環境安全性評估方法和評估標準，須要納米材料的生產者、管理者及毒理學研究者密切合作，最終建立一套相對全面、系統的納米材料安全評價標準，以指導納米CuO的安全生產和合理使用。

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