生化法處理后的鏈霉素廢水出水對斑馬魚SOD活性和MDA含量的影響

趙月+曹志會+王冰等

摘要： 采用暴露試驗方法，研究了10%、20%、30%、40%體積百分比的生化法處理后的鏈霉素生產廢水出水15 d 內對斑馬魚肌肉組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響。結果顯示，斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導為主，經過生化法處理后的鏈霉素生產廢水出水比例達到10%時就可以對斑馬魚產生氧化損傷效應，但是比例達到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統最終達到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統具有自我調節的功能。此外，斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產廢水的脅迫有應激反應，兩者有協同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。

關鍵詞： 鏈霉素；斑馬魚；抗氧化防御系統

中圖分類號： X703 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0348-03

隨著工業的發展，工業廢水排放對水生態系統、人類健康構成了巨大威脅，同時給環境風險評估和管理帶來了挑戰 [1]。目前我國工業廢水排放的監督管理以理化監測為主，能快速定量測定某些廢水中的污染物含量，但對于組分復雜的工業廢水，難以用理化分析方法闡明其組分。因此，建議采用水生生物毒性試驗來反映廢水的綜合毒性 [2-3]。制藥企業污水處理廠、城市污水處理廠的污水處理工藝對制藥廢水中的污染物質去除仍不夠徹底 [4]。王麗萍等利用鯉魚、鯽魚對污水處理廠廢水的急性毒性進行了檢測，結果表明，鯉魚對水質毒性的敏感性高于鯽魚，出水對魚的毒性主要是由水中游離氨引起的 [5]。李麗君等用斑馬魚檢測幾家工業污染源廢水毒性，對各行業廢水的毒性、污水處理的效果以及污水的綜合毒性進行了客觀評價，結果顯示，大部分行業的工業廢水經處理后仍具有毒性 [4]。沈洪艷等采用暴露試驗法研究了青霉素、土霉素混合廢水的出水不同暴露濃度對斑馬魚肌肉超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響，結果表明，該廢水對斑馬魚機體造成了一定的氧化損傷 [6]。錦鯉長期暴露于鏈霉素廢水中會對其抗氧化防御系統及抗氧化能力產生影響 [7]。斑馬魚是國際標準組織推薦的試驗用魚，斑馬魚成魚個體比其他魚種小，便于在實驗室飼養，具有繁殖能力強、價格便宜等特點，被廣泛應用于胚胎發育生物學研究、動物學基因表達研究、毒物在生物體內殘留累積效應研究、污染物對于魚類急性毒性研究等 [8-9]。本研究選取某大型鏈霉素生產企業污水處理廠生化法處理后的二沉池出水為水樣（以下簡稱鏈霉素廢水出水），以斑馬魚為研究對象，評估鏈霉素廢水出水對魚體肌肉組織SOD活性、MDA含量的影響，旨在為評價制藥工業廢水處理工藝有效性以及處理后出水的生態安全性提供依據。

1 材料與方法

1 1 儀器和試劑

UV-2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）、DK-S26 型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）、TG16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、JPBJ-608型便攜式溶解氧測定儀（上海精密科學與儀器有限公司）、EL204型電子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）、FE20型pH計（梅特勒-上海托利多有限公司）、XK96-B型快速混勻器（姜堰新康醫療器械有限公司）、BBC-226STV海爾家用冰箱、SYZ-A型石英高純水蒸餾器（金壇市宏華儀器廠）、WAD-TH型硬度計、手動式勻漿器、溫度計、加熱棒、移液管等。試驗用SOD、MDA、考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，醋酸、乙醇、生理鹽水均購自天津永大化學試劑公司。

1 2 受試生物

選用斑馬魚為受試生物，由河北省石家莊市水產養殖基地提供，體長為（34 05±0 43） mm，體質量為（0 24±0 03） g， 魚苗經5%食鹽水消毒后進入實驗室，用 48 h 曝氣的脫氯自來水在實驗室馴養7 d用于試驗，試驗水質符合漁業水質標準，馴養期間斑馬魚死亡率<4%。為防止餌料產生影響，試驗前24 h停止喂食，整個急性試驗期間不喂食。

1 3 方法

預試驗：在27 cm×13 cm×15 cm的玻璃水族缸中每缸盛放4 L試液，分別設置8個預試驗濃度組，鏈霉素出水體積百分比分別為：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用曝氣48 h的除氯自來水進行稀釋，水質指標滿足GB 11607—1989 《漁業水質標準》。每組隨機放入10尾魚，連續試驗 96 h，每天更換試驗溶液。試驗結果顯示，連續試驗96 h后，并未觀察到任何1個試驗組的斑馬魚全部死亡。急性毒性試驗：根據上述預試驗結果進行急性試驗濃度設置，鏈霉素廢水出水選擇20%、40%、60%、80%、100%體積百分比來觀察鏈霉素廢水出水對斑馬魚造成的影響，每組10尾魚。亞急性毒性試驗：對于鏈霉素廢水出水，設定亞急性毒性試驗濃度為：10%、20%、30%、40%，研究不同暴露濃度鏈霉素廢水出水對斑馬魚的氧化損傷。試驗設置1個空白組、4個試驗組，每個試驗組設置3個平行組。在5 L魚缸中分別放入4 L試驗液，充分混合曝氣后將馴養的斑馬魚隨機放入各個試驗組中，每組投放20尾魚，并進行連續曝氣。亞急性毒性試驗歷時 15 d，每天至少測定1次試驗液中的溶解氧含量、pH值、硬度、水溫。采用靜態置換法，每天換水，分別于3、6、9、12、15 d測定斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量。

1 4 樣品處理

每次從相應的試驗組中取5尾試驗魚，解剖，取其肌肉組織，在冰冷的0 86%生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準確稱取組織質量，放入玻璃勻漿管中；用移液器按1 ∶ 9（質量體積比）取預冷的0 86%生理鹽水，加入勻漿管中進行勻漿，在冰水浴中進行勻漿，充分研磨約8 min，制得10%組織勻漿。將制備好的勻漿液用普通離心機在3 000 r/min下離心10 min，取其上清液保存于4 ℃冰箱中。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；采用硫代巴比妥酸反應（TBA）比色法測定MDA含量。endprint

1 5 試驗條件

試驗所用廢水來自鏈霉素生產過程中的提煉工段，化學需氧量（COD）、生化需氧量（BOD5）、懸浮物、氨氮濃度分別為200、50、50、4 12 mg/L，色度為21。試驗用水pH值約75，總硬度約100 mg/L，試驗溫度為22～24 ℃，溶解氧含量不低于5 mg/L。試驗期間用曝氣裝置連續曝氣，為了保證其濃度，每24 h換1次試驗液，每天至少測定1次試驗溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量。

1 6 數據處理

試驗結果用“平均值±標準差”來表示。

2 結果與分析

2 1 急性毒性試驗結果

96 h內，80%、100%濃度組斑馬魚出現側翻現象，游動十分遲緩。80%濃度組斑馬魚死亡4尾，100%濃度組斑馬魚死亡5尾。40%、60%濃度組斑馬魚游動緩慢，未出現側翻。20%濃度組斑馬魚行為未出現明顯異常。黃健等選用鏈霉素對6種海洋微藻進行試驗，結果表明，只有角毛藻、三角褐指藻在試驗濃度范圍內（0～500 mg/L）測到了72 h半抑制濃度，EC50分別為346、445 mg/L，其他4種海洋微藻均未測到72 h半抑制濃度 [10]。

2 2 亞急性毒性試驗

2 2 1 生化法處理后的鏈霉素生產廢水出水對斑馬魚肌肉SOD活性的影響 由圖1可知，3 d時，10%試驗組斑馬魚體內SOD活性比對照增加，但無顯著差異；20%、30%、40%試驗組斑馬魚體內SOD活性出現顯著性誘導作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚氧化應激反應。斑馬魚通過升高SOD活性來抵御 O-2[KG- 2]· 對機體的侵害作用。6 d時，10%試驗組斑馬魚體內SOD活性比對照增加；20%、30%試驗組則表現出抑制作用，但無顯著性差異；40%試驗組表現出顯著抑制作用。這可能是因為隨著暴露時間的延長，鏈霉素廢水中污染物在魚體內不斷地累積，導致魚體內產生大量O-2·，過多的O-2·消耗了SOD，也可能是過量的O-2·對魚體抗氧化酶產生了直接損傷，導致SOD活性降低。9 d時，10%試驗組表現為對SOD活性有誘導作用但無顯著差異，其值略高于空白對照組；20%、30%、40%試驗組均表現為抑制作用但無顯著性差異，其值略低于空白對照組。12 d時，10%、30%試驗組表現出抑制作用但無顯著差異；20%試驗組表現出誘導作用但無顯著性差異；40%試驗組表現出顯著誘導作用。15 d時，10%、40%試驗組顯現出誘導作用但無顯著差異；20%、30%試驗組表現出抑制作用但無顯著差異。綜上所述，生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時對魚體影響是可逆的，并未超過其抗氧化防御系統閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統最終達到了新的平衡。

2 2 2 生化法處理后的鏈霉素生產廢水出水對斑馬魚肌肉MDA含量的影響 如圖2所示，3 d時，10%、20%、30%、40%試驗組斑馬魚肌肉MDA含量均表現為誘導作用，但是無顯著差異。6 d時，20%、30%試驗組斑馬魚肌肉MDA含量均表現為顯著誘導作用。9 d時，30%試驗組出現抑制作用但無顯著差異；10%、20%、40%試驗組表現為誘導作用但無顯著差異。試驗后期（9～15 d），所有試驗組MDA含量均與空白對照組無顯著差異。綜上所述，3 d時所有試驗組斑馬魚肌肉MDA含量均表現出誘導作用，說明生化法處理后的鏈霉素廢水出水比例為10%時就已經引起了魚體脂質過氧化損傷；6 d時20%、30%試驗組顯現出顯著誘導效果；9～15 d 時，10%、20%、40%試驗組與空白對照組無顯著差異。本試驗濃度范圍已經引起了斑馬魚脂質過氧化損傷，9～15 d時與空白對照組無顯著差異，說明斑馬魚抗氧化防御系統達到了新的平衡，該試驗結果與SOD活性測定結果一致。

3 結論與討論

3 1 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對SOD活性影響

SOD是生物體內抗氧化防御系統中重要的抗氧化酶，主

要分布在胞漿和線粒體的基質內 [11-13]，由于其是唯一1種以自由基為底物的抗氧化酶，因此在活性氧自由基清除方面中發揮著重要作用。本研究結果表明，暴露初期（3 d），暴露組SOD活性較空白組升高，說明斑馬魚在受到外界刺激時，生物體內陰離子氧自由基數量增多，SOD被激活，保護系統被打開，陰離子氧自由基刺激了SOD合成來清除陰離子氧自由基，減少細胞膜的過氧化作用。隨著暴露時間的延長（6～9 d）， SOD活性因消耗而降低，或者SOD合成受到抑制。該研究結果與前人的研究結果 [6，14]一致，即生物體暴露于污染環境后其SOD活性均出現先誘導后抑制現象。這可能是因為鏈霉素廢水中污染物在魚體內累積，導致陰離子氧自由基在魚體內累積速度加快，從而使SOD合成速度跟不上斑馬魚體內陰離子氧自由基增加速度，抑制了SOD合成，也可能是SOD因消耗而活性降低，導致陰離子氧自由基的產生和消除平衡被破壞，機體細胞膜系統被氧化。暴露后期（12～15 d），SOD活性回到空白對照水平，可能是由于此時機體已對暴露物的逆境脅迫表現出了一定的耐受性，而且該污染脅迫沒有超出魚體耐受力，SOD再次被刺激，產生應激反應，活性再度升高，說明魚體內抗氧化防御系統正在發揮作用，并且形成新的平衡。

3 2 生化法處理后的鏈霉素廢水出水對MDA含量影響

MDA作為氧化損傷最終形成的脂質過氧化產物，其含量可間接反映機體自由基水平，是毒性作用、保護作用的綜合反映 [15]。研究發現，當污染物進入生物體內進行生物轉化時，可形成大量活性氧自由基，這些活性氧自由基若不及時清除，就會引起DNA斷裂、脂質過氧化、酶失活等損傷，對機體造成氧化脅迫 [16]。暴露初期（3 d），所有暴露組MDA含量較空白升高，這與SOD活性變化規律一致，說明斑馬魚在受到外界刺激時，MDA含量與SOD活性同時被激活，魚體通過產生MDA來清除陰離子氧自由基對生物體的迫害，說明此時斑馬魚已經受到脂質過氧化損傷。隨著暴露時間的延長，MDA含量存在一定程度的顯著誘導。暴露后期（9～15 d），MDA含量維持在對照水平，說明魚體消除了過多的陰離子氧自由基，達到了新的平衡，表明該污染脅迫仍在魚的承受范圍內，這與沈洪艷等關于抗生素藥物環丙沙星對錦鯉抗氧化系統的毒性作用結果 [17]一致。隨著暴露時間延長與暴露濃度升高，SOD活性逐漸下降，與此同時，MDA含量呈現上升趨勢 [18]。本試驗中，30%試驗組出現MDA含量低于對照組的情況，也有不少學者發現了同樣的現象 [19-22]。本試驗結果原因可能是隨著自由基的積累，雖然SOD活性下降，但是機體內還存在其他酶被激活，清除過多陰離子氧自由基的作用，從而使魚體內的抗氧化防御系統保持在穩定狀態。endprint

斑馬魚暴露在生化法處理后的鏈霉素廢水出水中15 d，40%體積百分比試驗組斑馬魚魚體SOD活性呈現出誘導—抑制—誘導—回落的趨勢，說明該試驗組鏈霉素廢水出水能夠引起斑馬魚的氧化應激反應，并且15 d時機體已對鏈霉素廢水出水的逆境脅迫表現出了一定的耐受性。MDA含量均呈現誘導—回落的趨勢，說明經過生化法處理后的10%、20%、30%、40%體積百分比鏈霉素廢水出水均能夠引起斑馬魚的脂質氧化性損傷， 但是其污染脅迫水平在斑馬魚可以承受的范圍之內。斑馬魚肌肉組織SOD活性、MDA含量在暴露過程中以誘導為主，表明經過生化法處理后的鏈霉素生產廢水出水比例達到10%時就可以對斑馬魚產生氧化損傷效應，但是比例達到40%時其對斑馬魚的氧化損傷程度并未超過其抗氧化防御系統的閾值，斑馬魚的抗氧化防御系統最終達到了新的平衡，說明魚體抗氧化防御系統具有自我調節功能。斑馬魚SOD活性、MDA含量均對鏈霉素生產廢水出水的脅迫有應激反應，兩者有協同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。

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