鹽堿化土壤中1株耐鹽解磷放線菌的生物學特性

李學平　劉萍

摘要： 采用平板法進行菌種初篩和生物學特性研究，經篩選純化得到1株高效解磷菌F1312，對該菌株的生物學特性在碳源、氮源、溫度、pH值等方面進行了初步研究，并采用L9（34）正交試驗設計對發(fā)酵條件進行了初步探討。結果表明：經篩選所得的菌株F1312初步判斷為放線菌；對F1312進行生物學測定，該菌株在所供4種碳源、氮源、pH值、溫度條件下均能生長，其最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母浸膏粉，最適pH值為7，最適溫度為30 ℃；在發(fā)酵條件的優(yōu)化組合試驗中，F(xiàn)1312的最適解磷條件為：pH值=7，溫度30 ℃，碳氮比20 ∶ 1，轉速150 r/min。

關鍵詞： 高效解磷菌；生物學；解磷效果；正交試驗；放線菌

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0363-03

在土壤性質、作物類型、磷肥種類和用量等一系列因素的影響下，每年施入的磷大約有75%～90%積累在土壤中成為難溶形態(tài)的磷 [1]，當季利用率一般僅為10%～25% [2]。因此，如何提高磷肥利用率一直備受研究人員關注。

大量研究表明，土壤中的許多微生物都能夠將植物難以吸收利用的無效磷轉化為可吸收利用的有效磷形態(tài) [3-5]，這種微生物叫解磷菌。土壤中解磷菌能夠增加磷酸鈣的溶解性，提高土壤中的可溶性磷含量，從而提高植物對磷的利用效率，改善植物營養(yǎng)條件 [6]。對不同種類解磷微生物溶磷效果的研究發(fā)現(xiàn)，細菌、酵母、霉菌接種在不同磷源上時，表現(xiàn)出的溶磷能力不同 [7-11]。因此，研究解磷菌的解磷特性以及生物學特性，對促進植物生長發(fā)育以及解磷真菌在農學上的應用起著重要作用。本研究采集草坪根際土壤，對解磷菌進行篩選并進行生物學特性研究，并對發(fā)酵液條件優(yōu)化組合進行研究，以探討解磷菌的最適生長環(huán)境以及解磷的最適合條件。

1 材料與方法

1 1 供試樣品

采集內陸鹽堿地草坪根際土壤，采用抖土法將收集的土樣放入密封袋內立刻帶回實驗室冷藏，備用。

1 2 培養(yǎng)基配方

1 2 1 基礎培養(yǎng)基 本試驗中菌種初篩用的是有機磷固體培養(yǎng)基和無機磷固體培養(yǎng)基，配方如下：（1）有機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。（2）無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

1 2 2 保存培養(yǎng)基 菌種保存時用到的培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 15 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 0 5 g，KCl 025 g，MgSO4·7H2O 0 25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 005 g，瓊脂 8 g，蒸餾水500 mL，自然pH值。

1 2 3 復篩培養(yǎng)基 菌種復培（純化）時用的培養(yǎng)基為有機磷液體培養(yǎng)基和無機磷液體培養(yǎng)基，配方為：

（1）有機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，蒸餾水 1 000 ml，pH值7 0～7 5。

（2）無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

1 2 4 活化培養(yǎng)基 經過觀察，知道純化所得的菌種為放線菌類，所以活化時用到的培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaCl 0 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 01 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 4～7 6。

1 2 5 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的培養(yǎng)基為無機培養(yǎng)基和有機培養(yǎng)基，配方為：

（1）有機培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4[KG 3]0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7 0～7 5。

（2）無機培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

以上培養(yǎng)基制作完成之后均須在高壓滅菌鍋中，于 121 ℃、0 103 MPa條件下滅菌20 min。

1 2 6 發(fā)酵條件優(yōu)化組合 本試驗中發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的是4因素（溫度、pH值、碳氮比、轉速）3水平的正交試驗（表1）。根據(jù)試驗結果，綜合分析確定菌株生長的最適條件。endprint

1 3 菌株篩選

1 3 1 初篩 按照培養(yǎng)基配方與配量分別稱取各藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各培養(yǎng)基成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶；將燒杯放在石棉網上文火加熱，并不斷攪拌，使各藥品快速溶解，然后補充水分至所需配培養(yǎng)基的量；用 1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至7 0～7 5；將配置好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶內，加上棉塞包裝滅菌。高壓滅菌后倒平板，次日，將采集的土壤過篩磨細，稱取10 g樣品，進行梯度稀釋至10 -7、10 -8、10 -9，分別滴加菌液于相應編號的平板表面，每個梯度做3個重復，用涂布器涂布均勻，20～30 min后倒置，并放于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天觀察平板，記錄菌落出現(xiàn)的日期、菌落解磷能力出現(xiàn)日期、菌落直徑、解磷圈出現(xiàn)日期及直徑大小。培養(yǎng)7 d后，得到解磷能力比較強的菌株進行純化培養(yǎng)，將純化培養(yǎng)幾代的菌株進行菌種保存。

1 3 2 復篩 采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，將解磷微生物培養(yǎng)在難溶性磷液體培養(yǎng)基上，按照配方配制液體培養(yǎng)基進行高壓滅菌，在超凈工作臺上，按照無菌接種法，接種純化后的解磷真菌于發(fā)酵液，置于搖床中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng) 7 d，每天觀察發(fā)酵液的變化，并記錄菌絲球的出現(xiàn)日期、菌絲球顏色，目測其大小。發(fā)酵結束后，進行發(fā)酵液有效磷測定。

1 3 3 生物學測定 本次試驗采用察氏培養(yǎng)基進行試驗，其配方如下：碳源30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 ml，自然pH值。

2 結果與分析

2 1 菌種篩選

將菌懸液通過涂布平板法進行培養(yǎng)后得到了20株解磷效果較好的解磷菌株。通過對菌種初篩時得到的20株菌株的培養(yǎng)及解磷能力的測定，得到了1株高效解磷菌F1312。高效解磷菌F1312解磷能力達318 26 mg/L。

2 2 菌種形態(tài)觀察及分類地位初步確定

培養(yǎng)皿中的菌株呈放射狀，生長初期為白色，穩(wěn)定后為青色。液體培養(yǎng)為白色菌絲球，球狀，直徑3～5 mm，發(fā)酵液為乳白色，黏稠，拉絲。由顯微鏡觀察后，發(fā)現(xiàn)其菌絲直徑為 1 μm，孢子呈橢圓形，直徑為1～1 2 μm，長為2～2 3 μm。初步確定為放線菌。

2 3 菌株解磷生物學特性研究

2 3 1 不同碳源對菌株生長的影響 碳源明顯影響菌株F1312的生長（圖1）。當以麥芽糖為唯一碳源時，其生長情況最好，一直呈快速生長狀態(tài)。其次為葡萄糖，前3 d呈現(xiàn)出快速生長的趨勢，之后趨于平緩，且前5 d內其菌落直徑大于麥芽糖。當以蔗糖為唯一碳源時，前4 d呈顯出快速生長的趨勢，之后幾天趨于平緩。以乳糖為唯一碳源時，前5 d雖然也表現(xiàn)出較快的生長趨勢，但相對于其他3種碳源，其生長一直緩慢，菌落直徑最小。培養(yǎng)7 d時，當碳源為麥芽糖時菌落直徑最大，達到38 0 mm，菌種長勢相對最好，葡萄糖和蔗糖相近，分別為35 0 mm和34 0 mm，乳糖相對生長最差，為31 0 mm。

2 3 2 不同氮源對菌落生長的影響 不同氮源明顯影響菌株F1312的生長（圖2）。當以酵母浸膏粉為唯一氮源時，其生長最為迅速。其次為硝酸鉀，然后是硝酸鈉，最差的為亞硝酸鈉。前4 d酵母浸膏粉培養(yǎng)基上的F1312菌株和硝酸鉀培養(yǎng)基上F1312菌株生長情況大體相同，之后3 d酵母浸膏粉上的F1312菌株生長迅速。培養(yǎng)7 d時，以酵母浸膏粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上的菌株菌落直徑最大，達到了 48 0 mm。以硝酸鉀為唯一氮源時，菌落直徑次之，為 45 0 mm。當以硝酸鈉為唯一氮源時菌落直徑再次之，為36 mm。當以亞硝酸鈉為唯一氮源時菌落直徑最小，菌株相對生長最差，其菌落直徑僅為2 7 mm。

2 3 3 不同溫度對菌落生長的影響 溫度對解磷菌的生長影響較大（圖3）。在不同溫度下，菌株F1312一直呈現(xiàn)出快速[CM（25]增長的趨勢。當溫度為30 ℃時菌落直徑最大，達到45 0 mm。當溫度為20 ℃時菌落直徑最小，為36 0 mm。25 ℃ 和 35 ℃ 菌落直徑相近，分別為38 0 mm和43 0 mm。

2 3 4 不同pH值對菌落生長的影響 pH值對菌株F1312生長的影響并不是很大（圖4）。培養(yǎng)7 d時，菌落直徑最大的是pH值=7的培養(yǎng)基上的菌落，其直徑為48 0 mm；菌落直徑最小的是pH值=9的培養(yǎng)基上的菌落，其穩(wěn)定狀態(tài)時的菌落直徑為42 0 mm。pH值=6的培養(yǎng)基為第二，其菌落直徑為460 mm。pH值=8的培養(yǎng)基為第三，其菌落直徑為44 0 cm。這說明菌株F1312生長環(huán)境偏酸性。當pH值在 6～7 之間時，菌落直徑的趨勢是隨著其增大而增大，當pH值在7～9之間時，菌落直徑隨著其增大而減小。所以當pH值超過7時，pH值對該菌種的生長具有明顯的抑制作用。

2 4 解磷菌株F1312發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株F1312不同試驗組發(fā)酵液有效磷含量差異較大（表2），通過不同發(fā)酵條件組合發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵的最適條件為：溫度30 ℃，pH值=7，碳氮比20 ∶ 1，轉速150 r/min，此條件下該菌株解磷能力最強。

3 結論

（1）高 效解磷菌F1312為放線菌，其解磷量為318 26 mg/L。

（2）F1312生長的最適pH值=7，最適溫度為30 ℃，最適碳源為麥芽糖，不同碳源中其長勢順序是：麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>乳糖；最適氮源為酵母浸膏粉，不同氮源中長勢順序是：酵母浸膏粉>硝酸鉀>硝酸鈉>亞硝酸鈉。（3）該菌株最適發(fā)酵條件為：pH值=7，溫度30 ℃，碳氮比20 ∶ 1，轉速 150 r/min。

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