生防放線菌代謝產淀粉酶工藝的優化

李堆淑

摘要： 從陜西省商洛市商州區不同植被下采取土樣，分離出65株生防放線菌，其中從苜蓿中分離的MX3菌株對黃芩根腐病菌的生防效果最強。采用單因素試驗及正交試驗對MX3菌株代謝產物產淀粉酶活性進行測定，優化發酵條件。結果表明：單因素試驗得出MX3菌株的最佳碳源、氮源分別為玉米粉、酵母膏，最適裝液量為125 mL，最適溫度為28 ℃，最適初始pH值為6 0，最適搖床轉速為130 r/min，最適發酵時間為6 5 d。由正交試驗得到MX3菌株的最佳發酵條件組合為裝液量125 mL、pH值7 0、發酵時間5 5 d、搖床轉速200 r/min。

關鍵詞： 生防放線菌；淀粉酶；發酵液；正交試驗；發酵條件；優化

中圖分類號：Q939 97 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0376-03

生防放線菌，尤其是鏈霉菌屬是藥物研究的重要微生物資源，也是微生物生長發育和代謝產物研究的良好材料 [1-2]。放線菌的鏈霉菌屬及其相關類群也用在植物病害的生物防治方面，生防放線菌在寄主體外通過各種生物作用降低病原菌侵染 [3-4]。Kemira將從泥煤中分離的灰綠鏈霉菌作為制劑，主要用于防治鐮刀菌、腐霉菌、疫霉菌、絲核菌等土傳病原菌 [5]。我國研制的細黃鏈霉菌“5406”不但能夠防治多種植物病原菌的生長，還對植物生長具有促進作用 [6]，也可以在寄主植物組織內誘發其產生抗性。淀粉酶對淀粉的水解作用是生物體利用淀粉進行新陳代謝的初級反應，也是工業上產量最大的酶制劑品種 [7]。淀粉酶分布廣泛，遍及微生物及高等植物，其種類繁多，特點各異，用途較廣，主要應用于發酵、果汁、食品加工、醫藥、造紙、印染、洗滌劑、工業副產品、青貯飼料及廢料的處理等多種領域 [8-10]。目前對細菌產淀粉酶的研究較多，其中研究芽孢桿菌產淀粉酶 [11-14]、放線菌產淀粉酶的較少 [15]。生防放線菌的研究主要集中于抑菌性 [16-17]，但對高抗菌、高產淀粉酶的放線菌研究未見報道。因此，本研究從陜西省商洛市商州區苜蓿地采集土樣，通過選取培養基組成和培養條件等因素進行試驗，以期獲得生防放線菌代謝產物產淀粉酶的最優發酵條件，不僅為研究生防放線菌在不同條件下的高抗菌性作了鋪墊，而且為開發新菌株用于淀粉酶工業的研究提供依據。

1 材料與方法

1 1 材料

1 1 1 供試材料 從陜西省商洛市商州區不同植被模式下采集土樣，分離出65株生防放線菌；從黃芩根部分離的黃芩根腐病菌。[LL]

1 1 2 培養基 高氏1號培養基（改良）：每300 mL培養基中滴加1 mL 50 μg/mL K2Cr2O7；馬鈴薯培養基（PDA）；種子培養基；淀粉發酵培養基（150 mL規格的三角瓶中裝液量為125 mL）。

[BT2++0 2mm]1 2 試驗方法

1 2 1 粗酶液淀粉酶活性測定 采用3，5-二硝基水楊酸顯色法測定酶活性 [18]。在60 ℃、pH值=6 0的條件下，1 h內2%的可溶性淀粉溶液中釋放出1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活性單位。

1 2 2 單因素試驗對MX3菌株發酵條件的優化 活化斜面保存的MX3菌株，接種到改良的高氏1號培養基上，于28 ℃恒溫培養箱中培養5 d后，以4%的接種量接種培養5 d的種子培養液；再將種子培養液以10%的接種量接種于發酵液中，在28 ℃、130 r/min條件下培養5 d后，測定MX3菌株發酵液的淀粉酶活性。

主要單因素的設置為：（1）碳源：淀粉、玉米粉、牛肉膏、碳酸鈉、葡萄糖；（2）氮源：黃豆餅粉、硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、酵母膏；（3）裝液量：50、75、100、125、150 mL；（4）溫度：25、28、30、35、37 ℃；（5）初始pH值：6 0、7 0、8 0、9 0、10 0；（6）發酵時間：5 0、5 5、6 0、6 5、7 0 d；（7）搖床轉速：80、100、130、150、200 r/min。

1 2 3 正交試驗對MX3菌株發酵條件的優化 根據單因素試驗所得的各個最佳發酵條件進行正交試驗，詳見表1設計的因素水平和表2組合的L9（34）發酵條件，發酵培養各組合的MX3菌株發酵液，測定其發酵液的淀粉酶活性。

2 結果與分析

2 1 單因素試驗結果

2 1 1 確定MX3菌株發酵液的最佳碳源 采用改良高氏1號培養基，用淀粉、玉米粉、牛肉膏、碳酸鈉、葡萄糖5種碳源，測定MX3菌株發酵液的淀粉酶活性，從中篩選最佳碳源。如表3所示，酶活性排序為玉米粉>可溶性淀粉>碳酸鈉>牛肉膏>葡萄糖，可見玉米粉作為碳源時，MX3菌株發酵液的淀粉酶活性最大，為17 45 U/mL，因此玉米粉為最佳碳源。

2 1 2 確定MX3菌株發酵液的最佳氮源 改良高氏1號培養基以玉米粉為碳源，對其進行最佳氮源選擇，采用黃豆餅粉、酵母膏、硝酸鈉、蛋白胨、硫酸銨5種氮源，測定MX3菌株發酵液的淀粉酶活性。如表3所示，酶活性排序為酵母膏>硝酸鈉>黃豆餅粉>蛋白胨>硫酸銨，可見以酵母膏作為氮源時，MX3菌株發酵液的淀粉酶活性最大，為43 05 U/mL，因此認為酵母膏為最佳氮源。

2 1 3 確定MX3菌株發酵液的最佳裝液量 改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，在150 mL的三角瓶中分別裝入發酵培養基50、75、100、125、150 mL，接種MX3菌株。如表3所示，當裝液量增加到125 mL時，發酵液的淀粉酶活性達到最大值，為11 51 U/mL；發酵液量繼續增加，其淀粉酶活性下降，可見MX3菌株發酵液最佳搖瓶裝液量為125 mL（三角瓶規格150 mL）。

2 1 4 確定MX3菌株的最佳培養溫度 改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規格150 mL），溫度分別設為25、28、30、35、37 ℃，培養 5 d 后測定MX3菌株各發酵液的淀粉酶活性。如表3所示，溫度對發酵液中淀粉酶活性有一定的影響，溫度在25～28 ℃，隨著溫度的升高，發酵液的淀粉酶活性逐漸增大，在 28 ℃ 時，其淀粉酶活性達到最大值，為4 49 U/mL；當溫度升高到30、35、37 ℃時，發酵液的淀粉酶活性逐漸減小，說明溫度偏高不利于MX3菌株的發酵培養，因此認為28 ℃為MX3菌株的最佳培養溫度。endprint

2 1 5 確定MX3菌株發酵液初始pH值 改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規格150 mL），于28 ℃培養。將MX3菌株發酵液初始pH值分別調至6 0、7 0、8 0、9 0、10 0，然后分別培養 5 d，測定MX3菌株發酵液的淀粉酶活性。如表3所示，當發酵液初始pH值為6 0時，其淀粉酶活性最大，為6 26 U/mL；隨著發酵液的初始pH值增加，MX3菌株發酵液代謝產物淀粉酶活性逐漸減小。

2 1 6 確定MX3菌株的最佳發酵時間 改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規格150 mL），于28 ℃培養，pH值設為6 0，篩選MX3菌株最佳發酵時間，每隔12 h取樣。如表3所示，MX3菌株發酵液培養5 0～6 5 d時，發酵液的淀粉酶活性不斷增大，在6 5 d時其淀粉酶活性最大，為10 80 U/mL；繼續延長培養時間，其淀粉酶活性不斷降低，培養7 0 d時，其淀粉酶活性已經下降為0 92 U/mL（表中未列），因此最佳的發酵時間為6 5 d。

2 1 7 確定MX3菌株發酵培養的最佳搖床轉速 改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規格150 mL），于28 ℃培養，pH值設為6 0，發酵時間為6 5 d，MX3菌株發酵液的搖床轉速分別設為0、100、130、150、200 r/min，分別測定其發酵液的淀粉酶活性。如表3所示，隨著搖床轉速的增加，其發酵液的淀粉酶活性逐漸增大，轉速為130 r/min 時其發酵液的淀粉酶活性最大，為6 60 U/mL；隨后，再增加發酵液的搖床轉速，其發酵液的淀粉酶活性緩慢下降。

2 2 正交試驗結果

根據4因素3水平的L9（34） 正交表設計9種不同的發酵培養條件，測定MX3菌株發酵液的淀粉酶活性，優化發酵條件。如表4所示，各因素的影響力排序為C>A>B>D，最優組合為組合A2B2C1D3，即裝液量125 mL、pH值為7 0、發酵時間5 5 d、搖床轉速200 r/min時，MX3菌株發酵液的淀粉酶活性最大，為35 71 U/mL，比改良高氏1號培養基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源時，以及單因素（裝液量、pH值、培養時間、搖床轉速）試驗的發酵液淀粉酶活性都高（表4）。

根據正交試驗結果可知，因素D（搖床轉速）對MX3菌株發酵液的淀粉酶活性的影響最小，經正交試驗結果的方差分析，因素D的均差平方和太小，與其他3個因素的均差平方和相差太大，因此可以將其合并到誤差效應中，用合并后的誤差效應做F檢驗，自由度大，靈敏度更大。F0 01（2，2）=99 0，F0 05（2，2）=19 0，F0 10（2，2）=9 0，由表5可見，FA< F0 10，FB< F0 10，F0 10

3 結論與討論

本試驗研究生防放線菌MX3菌株代謝產物產淀粉酶的活性，通過單因素試驗得出MX3菌株發酵液最佳單因素發酵條件：碳源為玉米粉、氮源為酵母膏、裝液量為125 mL、溫度為28 ℃、pH值為6 0、發酵時間為6 5 d、搖床轉速 130 r/min。根據選定的最佳碳源、氮源的培養基配方和4因素3水平的L9（34）正交試驗，確定最佳發酵條件組合，得出各因素的影響力排序為C>A>B>D，各因素的最優組合為A2B2C1D3，即生防放線菌MX3菌株發酵液的裝液量為 125 mL、pH值為7 0、發酵時間為5 5 d、搖床轉速為 200 r/min 時，MX3菌株發酵液的代謝產物產淀粉酶活性最大，為35 71 U/mL。經正交試驗結果的方差分析可知，發酵時間（C）對MX3菌株發酵液的淀粉酶活性有顯著影響，發酵液、pH值、搖床轉速對MX3菌株發酵液的淀粉酶活性影響都不顯著。通過本試驗優化生防放線菌MX3菌株最佳產淀粉酶活性的發酵條件。劉雪珠等通過紫外線、超聲波、熱等多種物理誘變選育的產淀粉酶放線菌A24，經優化培養其酶活性為 353 67 U/mL [19]，比本研究分離出的生防放線菌MX3菌株的淀粉酶活性高得多，主要是由于本研究的生防放線菌MX3菌株并未經過各種物理條件的誘導處理，其方法還須進一步研究。本研究分離出產淀粉酶生防放線菌MX3菌株，初步的酶學性質測定表明，該菌株應用前景較好，一方面放線菌MX3菌株既能被制成各種制劑應用于植物病害防治，同時不污染環境；另一方面能通過改良該菌株的遺傳與基因工程，使其有利于淀粉酶工業發展。

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