嗜鞣管囊酵母發酵條件對纖維素制備乙醇的影響

劉俊紅+楊紅霞+李子健等

摘要： 狗牙根中含有豐富的纖維素，經纖維素酶酶解形成的還原糖通過嗜鞣管囊酵母發酵可以得到生物乙醇。以狗牙根為原料，分析嗜鞣管囊酵母發酵過程中培養時間、接種量、pH值、溫度等因素對乙醇得率的影響，探索最佳的發酵工藝條件。結果表明， pH值為5 0、溫度40 ℃、嗜鞣管囊酵母菌液（1億個/mL）接種量0 073 0 mL/g、發酵時間 60 h 為生產乙醇的最佳條件，此時乙醇濃度為5 146 mg/mL。

關鍵詞： 生物乙醇；嗜鞣管囊酵母；發酵；纖維素；狗牙根

中圖分類號：TQ352 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0384 02

21世紀，社會經濟飛速發展，對能源的需求也越來越大，[JP+1]以煤炭為主的能源消耗結構是我國空氣質量不斷惡化的主要原因 [1]，尋找新的替代能源是當務之急。生物乙醇是一種新型能源，然而最初生物乙醇的生產主要以玉米、小麥為原料，不僅消耗大量農產品，成本高，而且威脅到國家的糧食安全，影響糧食的正常供應，導致農產品價格上漲等連鎖反應 [2-3]。因此，第2代利用纖維素生產生物乙醇的技術引起較大關注 [4]，這不僅可以大大緩解能源壓力，也可以避免人和能源之間的爭糧現象。狗牙根含有豐富的纖維素，經稀酸預處理，在纖維素酶和木聚糖酶作用下可降解得到還原糖，接種嗜鞣管囊酵母發酵可制備生物乙醇。本試驗通過研究pH值、時間、溫度、嗜鞣管囊酵母接種量等因素對狗牙根糖化液發酵產生乙醇得率的影響，通過正交試驗探索狗牙根糖化液制備乙醇的最佳發酵條件，為狗牙根的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1 1 試驗材料

從河南城建學院圖書館后的山腳下采集成熟的狗牙根（Bermuda grass）植株，洗凈烘干，用粉碎機粉碎，過60目篩，密封保存，備用。

1 2 主要試劑

葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉，天津市博迪化工有限公司產品；酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；纖維素酶、木聚糖酶，和氏璧生物技術有限公司產品。

1 3 試驗儀器

QE-100屹立高速中藥粉碎機，武義縣屹立工具有限公司生產；FA1004B電子天平，上海越平科學儀器有限公司生產；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司生產；LDZX-75KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠生產；PHSJ-3F pH計，上海精密科學儀器有限公司生產；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司生產；ZFD-A5250生化培養箱、HZQ-L恒溫培養搖床，上海智城分析儀器制造有限公司生產。

1 4 試驗方法

1 4 1 pH值測定 稱取狗牙根粉末1 g，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應60 min；調節pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，測還原糖的量；根據還原糖含量配制液體培養基，分別調pH值為4 0、4 5、5 0、5 5、6 0；滅菌，接種嗜鞣管囊酵母菌液（1億個/mL）0 094 9 mL/g，30 ℃搖床培養36 h；蒸餾測定乙醇含量。

1 4 2 溫度測定 稱取狗牙根粉末1 g分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應60 min；調節pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據還原糖含量配制液體培養基，調pH值為5 5；滅菌，接種菌液0 094 9 mL/g，分別放于20、25、30、35、40 ℃搖床中培養36 h；蒸餾測定乙醇含量。

1 4 3 接種量測定 稱取狗牙根粉末1 g分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應60 min；調節pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據還原糖含量配制液體培養基，調pH值為5 5；滅菌，分別接種菌液0 029 2、0 051 1、0 073 0、0 094 9、0 116 8 mL/g，放于30 ℃搖床中培養36 h；蒸餾測定乙醇含量。

1 4 4 時間測定 稱取1 g狗牙根粉末分裝在試管中，加入 1%稀鹽酸，120 ℃反應60 min；調節pH值為4 2，加入木聚糖酶和纖維素酶酶解，根據還原糖含量配制液體培養基，調pH值為5 5；滅菌，接種菌液0 094 9 mL/g，放于30 ℃搖床中分別培養36、48、60、72、84 h；蒸餾測定乙醇含量。

1 4 5 正交試驗 在單因素試驗基礎上設計4因素3水平正交試驗（表1），分析狗牙根纖維素發酵制備生物乙醇的最優工藝條件。

2 結果與分析

2 1 單因素試驗

2 1 1 pH值對嗜鞣管囊酵母發酵產量的影響 由圖1可見，嗜鞣管囊酵母適于在pH值為 4 5～5 0的酸性環境中生長；pH值為5 0時，生產出的乙醇濃度相對較高，為 2 259 mg/mL。pH值改變不太劇烈時，酶雖未變性，但會影響酶分子活性部位有關基團的解離，從而進一步影響酶與底物的結合或催化，使酶活性降低，也可能影響中間絡合物ES的解離狀態，不利于催化生成產物 [5]。因此，低于或高于最適pH值，都會影響乙醇的產量。

2 1 2 溫度對嗜鞣管囊酵母發酵產量的影響 溫度能夠影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構功能及細胞結構，而細胞膜的流動性及完整性均可影響微生物的生長、繁殖和代謝 [6]。由圖2可見，溫度過低或過高都會影響細胞生長，進而影響乙醇的得率；35 ℃時，菌株活力相對最為活躍，細胞膜的流動性達到最佳狀態，此時發酵液中乙醇濃度相對較高，為4 076 mg/mL；20 ℃時，菌種的發酵能力欠佳，生長速度比較緩慢，生長周期延長，積累的代謝產物乙醇產量相對較低。2 1 3 接種量對嗜鞣管囊酵母發酵產量的影響 由圖3可見，隨著接種量增加，乙醇得率也逐漸升高，接種量為 0 094 9 mL/g 時，乙醇的得率相對最高，為1 02 mg/mL；接種量過低，由于沒有足夠的酵母細胞進行發酵生產，培養基中的營養物質未得到充分利用，從而影響乙醇的得率。由于接種到新鮮培養液的種子細胞，一時缺乏分解或催化有關底物的酶或輔酶，或是缺乏充足的中間代謝物，在實際菌種生長過程中會產生誘導酶或合成有關的中間代謝物 [7-8]，這就需要有一段用于適應的時間，出現延滯期。在發酵工業中，為縮短延滯期以縮短生產周期，通常都會采用較大的接種量。但是，如果接種量過高，培養基既要滿足菌體生長，又要用于生產乙醇，反而會使乙醇的產量下降。2 1 4 發酵時間對嗜鞣管囊酵母發酵產量的影響 菌種發酵生產乙醇需要一個合理的發酵周期，發酵時間直接影響著乙醇的產量。由圖4可見，嗜鞣管囊酵母發酵培養的最佳時間為60 h，此時，發酵液中乙醇濃度為相對最高，為 2 442 mg/mL；發酵72 h時，發酵液中乙醇濃度有所降低，這是因為嗜鞣管囊酵母發酵初期以發酵液中的葡萄糖為碳源，酵母不斷代謝葡萄糖發酵成乙醇，而管囊酵母同化乙醇的能力很強 [9]；發酵超過72 h，發酵液中的葡萄糖含量減少，酵母可能開始利用乙醇為碳源來維持自身的生長和繁殖。endprint

2 2 正交試驗與工藝優化

由表2可見，影響乙醇產物得率的最關鍵因素是發酵溫度；嗜鞣管囊酵母發酵狗牙根生成乙醇的最佳條件為A2B3C1D2，即pH值為5 0、溫度40 ℃、接種量0 073 0 mL/g、時間60 h，此時，乙醇濃度最高，為5 146 mg/mL。

3 討論

目前，纖維素生產乙醇的研究主要集中于預處理方法的選擇、工藝的優化、酶水解成本的降低及乙醇轉化率的提高。利用預處理和雙酶降解纖維素后的還原糖為原料，接種單一的嗜鞣管囊酵母發酵制備乙醇，乙醇的得率往往相對較低，而多菌種混合發酵可充分利用培養基中的有效成分，提高乙醇的得率，這為進一步提高產量提供了依據 [10]。

參考文獻：

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[3]丁聲俊 我國發展生物燃料乙醇的長久大計[J] 糧食與食品工業，2010，17（3）：1-5

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[5]武玉學，靳 挺，王 強 嗜鞣管囊酵母發酵柑橘皮水解液生產乙醇的研究[J] 中國食品學報，2011，11（5）：32-36

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[7]傅致遠 生物質制取燃料乙醇的研究[J] 化學工程與裝備，2013（12）：42-44

[8]張 越，聶莉莉，宋 建，等 木質纖維素為原料的燃料乙醇預處理技術研究進展[J] 天津農業科學，2011，17（4）：113-116

[9]田毅紅，雷照方，龔大春 管囊酵母發酵生產乙醇的試驗研究[J] 釀酒科技，2008（1）：45-47

[10] 田 沈，藺增曦，姚瀅秋，等 嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus 1622）和重組大腸桿菌（E coli pGM-PA）乙醇發酵特性研究[J] 太陽能學報，2008，29（1）：95-99endprint