大腸濕熱型無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉與P16、β-catenin表達關系的研究

余鳳蓮，付肖巖，林巧云，林建龍，王 薇，鐘國棟，陳小玲，

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350108；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見三大惡性腫瘤之一，病死率居第二位［1］，在我國發病率、病死率在持續增加［2］。無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉（serrated adenoma/polyp，SSA/P）作為癌前病變之一，其可通過鋸齒狀途徑發展為CRC［3-4］，且當SSA/P伴異型增生（serrated adenoma/polyp-cytologic dysplasia，SSA/P-CD）時，向CRC發展的時間將會明顯縮短［5］，因此早期診治SSA/P對預防和減緩該病變發展至CRC至關重要。鋸齒狀病變癌變通路通常以CpG島甲基化為主要表型，伴隨基因突變和Wnt信號通路異常等，因此遺傳因素是導致CRC發生的重要因素，而在SSA/P癌變過程中多腫瘤抑制因子1（multiple tumor suppressor 1，P16）、β-連環蛋白（βcatenin）主要參與其中［6-7］。P16是一種抑癌基因，當基因突變和缺失時，細胞轉錄異常引起細胞無限自主增殖，導致腫瘤發生［8］。P16基因上的CpG島被高甲基化修飾后P16將失活，從而增加了鋸齒狀腺瘤癌變的可能性。β-catenin是Wnt信號通路中起到關鍵作用的分子，是擁有多種不同功能的一種蛋白質，主要參與同一類型細胞之間的黏附和作為信號轉導分子及基因的表達，在通路異常激活后促進腫瘤發生。研究發現，β-catenin的異常表達與鋸齒狀腺瘤癌變具有較大相關性，β-catenin表達異常隨著大腸鋸齒狀腺瘤的異型增生程度加重而變化［9］。前期研究和文獻報道發現，在臨床中大腸腺瘤中醫證型以大腸濕熱證和脾胃虛弱證居多［10-13］。本研究檢測大腸濕熱型SSA/P中P16、βcatenin的表達水平，并與脾胃虛弱型、健康人群進行比較，觀察3組表達有無差異，以初步探討大腸濕熱型無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉與P16、β-catenin表達的關系。

1 資料與方法

1.1 西醫診斷標準 SSA/P和SSA/P-CD診斷標準根據WHO提出的《WHO消化系統腫瘤分類》［14］中大腸鋸齒狀病變的組織學和分子病理學特征診斷。

1.2 中醫辨證標準 參照《24個專業105個病種中醫診療方案》［15］中大腸息肉中醫診療方案中大腸濕熱證及脾胃虛弱證的辨證標準。

1.3 納入標準 ①符合SSA/P和SSA/P-CD診斷標準者；②年齡18～65歲，不限制性別和種族；③自愿加入本研究，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①妊娠及哺乳期婦女；②病理診斷非SSA/P及SSA/P-CD者；③合并其他腺瘤者；④中醫辨證有兼證者；⑤合并有腸炎、腸潰瘍、消化道腫瘤等疾??；⑥合并有心、腦、腎、肝和血液系統方面等重大疾病，并（或）精神??；⑦不能完成完整的結腸檢查。

1.5 一般資料 選取2020年2月—2021年2月于福建中醫藥大學附屬第二人民醫院脾胃科住院及門診就診的SSA/P患者60例，中醫辨證符合大腸濕熱證者納入大腸濕熱證組，符合脾胃虛弱證者納入脾胃虛弱證組，其中大腸濕熱證30例為大腸濕熱證組，脾胃虛弱證30例為脾胃虛弱證組。另選我院健康體檢者的大腸正常黏膜組織20例作為正常對照組。大腸濕熱證組中SSA/P不伴異型增生（單純SSA/P）12例，SSA/P-CD 18例；脾胃虛弱證組中單純SSA/P 19例，SSA/P-CD 11例。3組性別、年齡及有無伴異型增生的情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 3組一般資料比較（±s）

表1 3組一般資料比較（±s）

組別正常對照組大腸濕熱證組脾胃虛弱證組例數20 30 30男12 18 16女8 12 14年齡/歲52.95±7.74 53.55±8.45 51.17±9.11單純SSA/P 0 12 19 SSA/P-CD 0 18 11

1.6 檢測指標及方法 采用免疫組織化學法檢測P16、β-catenin的表達情況。P16的陽性表現為胞核或部分胞漿染色為棕黃色者，在×200的高倍鏡下每張玻片隨機選擇5個視野統計陽性細胞數，按陽性細胞占比率和染色強度進行計分。參照BARNES等［16］半定量法進行評級，即陽性細胞所占比例及顯色深度分級乘積作為評分標準再進行評級。β-catenin蛋白的結果判定參考MARUYAMA等［17］方法，鏡下見胞膜陽性率大于70%為正常，小于70%為表達減弱或缺失；胞質或胞核陽性率大于10%為異位表達；表達減弱或缺失及異位表達均為異常表達。

1.7 統計學方法 采用統計軟件SPSS24.0進行統計學分析。計量資料經W檢驗（Shapiro-Wilk法）符合正態分布以（±s）表示，采用t檢驗分析；計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 3組P16陽性表達水平分布情況 見表2。

表2 3組P16陽性表達水平分布情況

2.2 3組β-catenin陽性表達水平分布情況 見表3。

表3 3組β-catenin陽性表達水平分布情況

2.3 2組不同病理分類中P16表達水平分布情況見表4。

表4 2組不同病理分類中P16表達水平分布情況

2.4 2組不同病理分類中β-catenin表達水平分布情況 見表5。

表5 2組不同病理分類中β-catenin表達水平分布情況

3 討論

中醫學認為，大腸息肉的致病因素與濕熱病邪有非常大的關聯，通常認為氣候環境、地理位置、飲食習慣、外感濕邪與內濕等因素均易導致濕熱證的發生，從而引起腫瘤易感性增加。分子機制研究表明，濕熱證候可通過炎癥、免疫、代謝、胃腸道微生態等環節塑造腫瘤免疫微環境的形成，促進腸道腫瘤發生和轉移。福州位于東南沿海，氣候潮濕，易感濕熱之邪，加之飲食習慣，口味偏甘，嗜食肥膩及煙酒之品，極易損傷脾胃、腸道。脾胃即傷則臟腑失和，濕邪內生，濕重濁而趨下，下犯腸腑，濕與熱搏結于腸道導致大腸腺瘤發病，故本病多見大腸濕熱證。謝丹楓等［18］研究提出濕熱可促進腫瘤發生發展，在基因水平上影響機體免疫和炎癥反應，修飾腫瘤微環境。P16和β-catenin作為腫瘤發生發展過程中的重要指標，P16蛋白也稱細胞周期調控蛋白，其一旦發生缺失或突變，將引起惡性腫瘤發生，目前已發現它具有較高的缺失或突變頻率，主要表現在腸癌、食管癌、胃癌、肺癌、宮頸癌和卵巢癌以及其他惡性腫瘤中［19-23］。β-catenin則是Wnt經典信號通路上的關鍵調控因子，如果出現調節異常，則會導致通路異常激活，β-catenin蛋白的表達水平隨之上升，從而導致腫瘤的發生［24］。

本研究結果顯示，P16蛋白的陽性表達率在大腸濕熱證組、脾胃虛弱證組中均低于正常對照組，P16蛋白隨著病變的發展，表達呈下調狀態，提示P16調控細胞周期并維持細胞有序增殖，推測P16基因失活使細胞生長失去控制，可能是導致大腸濕熱型SSA/P發生的重要因素，并在SSA/P病變通路中起推動作用。β-catenin蛋白陽性表達率在大腸濕熱證組、脾胃虛弱證組中均顯著高于正常對照組，提示β-catenin作為Wnt信號通路的關鍵分子，在轉錄黏附調劑機制中起著分子開關的作用，推測β-catenin異位表達增加使細胞黏附功能降低，參與SSA/P的形成。提示P16、β-catenin表達水平的變化可能在SSA/P的早期發生起作用。

單純SSA/P中P16蛋白和β-catenin在大腸濕熱證組、脾胃虛弱證組中陽性表達率差異無統計學意義；在SSA/P-CD中，P16蛋白和β-catenin在大腸濕熱證組的陽性率明顯較脾胃虛弱證降低和提高，提示SSA/P-CD中P16的低表達和β-catenin高表達可能與大腸濕熱證具有一定關系。P16低表達和β-catenin的高表達均參與了腺瘤的發生及癌變［6-7，9，25］，并在SSA/P到SSA/P-CD的發展進程中起重要作用。本研究提示，SSA/P伴有異型增生者，大腸濕熱證是一個應引起重視的證型，充分將西醫的病與中醫的證相結合，提高對臨床疾病的綜合判斷。

本研究發現在大腸濕熱型SSA/P-CD中，P16低表達和β-catenin高表達，提示SSA/P病變過程中大腸濕熱證的惡變可能性更高，針對大腸濕熱型的SSA/P內鏡下應積極治療和密切隨訪，但能否通過清熱化濕中醫干預治療，有待進一步研究。