從網絡藥理學角度比較草珊瑚指標成分迷迭香酸和氟西汀抗抑郁作用機制

祁克明，李 葉，林可欣，張家源，盧 偉，魏藝聰

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 ，350122）

根據報道，抑郁癥是導致殘疾的三大原因之一，目前全球有超過2.4億人患有抑郁癥［1］。抑郁癥的癥狀包括情緒和認知障礙，如情緒低落易怒、缺乏快感、疲倦、失眠或嗜睡、反應遲鈍、食欲不振等［2］。抑郁癥的發病機制比較復雜，主要與神經營養因子、下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸、單胺類神經遞質、神經可塑性、炎癥反應等有關［3-4］。雖然已有多種抗抑郁藥如氟西汀（fluoxetine，FLU）、氯胺酮等應用于抑郁癥患者的治療中，但僅對30%～40%的患者有效［5］，因此抗抑郁新藥的研發十分必要。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一種天然多酚化合物，主要存在于草珊瑚（又名腫節風）、薄荷、迷迭香、丹參、鼠尾草、麻黃、紫蘇等藥用植物中［6］，并且與異嗪皮啶共同作為中藥腫節風的質量控制成分被收錄入《中華人民共和國藥典》2020版［7］。研究表明，RA具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗抑郁、抗焦慮、抗腫瘤、抗菌、保肝等藥理作用［8］。大量研究表明，RA能夠通過調節單胺能神經遞質的傳遞、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、齒狀回新生細胞數量和炎癥反應等機制發揮抗抑郁作用［9］。氟西汀（fluoxetine，FLU）是一種廣泛應用于臨床的抗抑郁藥物，主要通過提高大腦內5-羥色胺（serotonin，5-HT）、BDNF，增強神經可塑性、促進神經發生來發揮抗抑郁作用［10］。氟西汀還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，可以提高腦內胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor Alpha，TNFα）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子發揮抗抑郁作用［11］。但目前尚無關于RA與FLU聯合用藥治療抑郁癥的相關研究。網絡藥理學是一種包括系統生物學、網絡分析、連通性、冗余和多效性的藥物設計方法，為新藥的發現和闡明化合物對疾病的作用機制研究提供依據，同時為提高藥物臨床療效和了解毒副作用提供重要依據［12］。本研究運用網絡藥理學研究方法預測RA治療抑郁癥的潛在途徑和可能的機制，并且以經典抗抑郁藥FLU作為對照，對比分析二者存在的異同點，從而為RA與FLU治療抑郁癥聯合用藥的研究提供理論依據。

1 方法

1.1 化合物信息的獲取 將rosmarinic acid和fluoxetine輸入化合物數據庫Pubchem中進行檢索，獲得RA和FLU的SMILES式、二維結構。

1.2 RA、FLU相關靶點的獲取 將化合物名稱輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），檢索得到潛在靶點。將化合物三維結構文件上傳至Pharmmapper數據庫，選擇“靶點（targets）”，類型為“僅針對人類蛋白質（human protein targets only）”，從結果中篩選出適配度（fit score）＞3分的靶點。將化合物三維結構文件上傳至SwissTargetPrediction和Stitch數據庫，選擇“物種（species）”為“人類（HOMOsapiens）”，獲得潛在靶點，并從SwissTarget-Prediction結果中篩選出可能性（probability）＞0的靶點。將以上4個數據庫的靶點合并去重，使用Uniprot數據庫將獲得的靶點轉換為人類基因標準名。

1.3 抑郁癥靶點的獲取 將“depression”“depressive disorder”“major depressive disorder”作 為 抑 郁癥關鍵詞，分別從治療靶點數據庫（therapeutic target database，TTD）、人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、GeneCards數據庫和基因疾病關聯數據庫（a database of genedisease associations，DisGeNet）獲得疾病靶點。篩選GeneCards數據庫中相關性得分（relevance score）＞10的靶點，TTD數據庫結果中Disease為Depression或Major depressive disorder的靶點，以及DisGeNet數據庫評分（score gda）＞0.2的靶點。將以上4個數據庫得到的靶點合并去重，轉換為人類基因標準名。

1.4 迷迭香酸和氟西汀治療抑郁癥靶點整合 篩選出RA與抑郁癥的交集靶點作為RA治療抑郁癥的候選靶點，FLU與抑郁癥的交集靶點作為FLU治療抑郁癥的候選靶點，并篩選出二者共同的候選靶點。

1.5 蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interactio，PPI）的構建及分析 將“1.4”得到的RA與抑郁癥和FLU與抑郁癥的交集靶點導入在線分析工具STRING數據庫中，選擇物種為“HOMO sapiens”構建“化合物-靶點”PPI網絡。將獲得的PPI網絡導入Cytoscape 3.8.2軟件中進行可視化處理，利用Network Analyzer功能計算節點度值（degeree），度值越大，則顏色越深，說明與該靶點相連的靶點越多，其相關度越大。此外，使用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE算法對PPI網絡進行聚類分析，提取核心基因模塊。

1.6 分子對接驗證 選擇RA的關鍵靶點蛋白進行分子對接驗證。將RA的二維結構導入Chem3D 19.0.0.22優化力學結構，導出為pdb格式。從PDB數據庫下載關鍵靶點蛋白分子的3D結構，采用Py-MOL 2.5.2對蛋白質去水，去配體，導出為pdb格式。利用AutoDockTools對蛋白質和RA加氫，轉換為pdbqt格式，進行分子對接。結合能≤-5.0 kcal/mol時具有良好的對接活性，結合能≤-7 kcal/mol時具有較強的對接活性。

1.7 生物學過程及通路分析 運用注釋、可視化和集成發現數據庫（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）對PPI網絡中靶點進行基因功能（gene ontology，GO）注釋和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，了解RA和FLU對治療抑郁癥可能的生物功能和信號途徑。

2 結果

2.1 RA和FLU治療抑郁癥靶點篩選 從TCMSP數據庫得到RA的潛在靶點18個，FLU潛在靶點0個；從Pharmmapper數據庫篩選得到RA潛在靶點114個，FLU潛在靶點42個；從Stitch數據庫得到RA靶點2個，FLU靶點10個；從SwissTargetPrediction數據庫得到RA靶點62個，FLU靶點42個。將獲得的疾病靶點整合去重，共得到RA潛在靶點179個，FLU潛在靶點87個。從TTD數據庫獲得抑郁癥潛在靶點32個，OMIM數據庫獲得靶點271個，GeneCards數據庫中得到靶點1 506個，DisGeNet數據庫得到靶點577個，整合后共得到抑郁癥潛在靶點1 753個。分別對RA和FLU治療抑郁癥的靶點進行篩選后，共得到63個RA作用于抑郁癥的候選靶點，45個FLU作用于抑郁癥的候選靶點，其中包含7個RA和FLU共同作用于抑郁癥的候選靶點。

2.2 基于PPI互作網絡的分析和預測 使用Cytoscape 3.8.2軟件分別建立RA與抑郁癥63個交集靶點、FLU與抑郁癥45個交集靶點的PPI網絡，并依據度值對蛋白互作進行可視化處理。結果表明，RA與抑郁癥的PPI網絡圖共包含了60個靶點和479條邊，見圖1A，度值排名前15的靶點為AKT1、MAPK1、CASP3、MMP9、IGF1、MAPK8、SRC、PTGS2、EGFR、CCL2、ESR1、MMP2、AR、JAK2、ERBB2。FLU與抑郁癥的PPI網絡圖共包含了45個靶點和220條邊，見圖1B，度值排名前15的靶點為BDNF、SLC6A4、OPRM1、MAOA、DRD2、CYP2D6、HTR1A、DRD4、SLC6A3、DRD3、SLC6A2、OPRK1、ADRA2A、IGF1、ACHE、CASR、HTR2A。將排名前15的靶點基因作為核心（HUB）靶點基因，二者度值排名前15的靶點均包含IGF1。使用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE算法對RA和FLU的PPI網絡進行聚類分析，RA共得到2個核心基因模塊，模塊1由24個節點和220條邊組成，得分為19.13分，模塊2由4個節點和5條邊組成，得分為3.333分。FLU共得到4個核心基因模塊，模塊1由15個節點和91條邊組成，得分為13.143分，模塊2～4均由3個節點和3條邊組成，得分均為3分，見圖2。

圖1 迷迭香酸（A）和氟西汀（B）與抑郁癥交集靶點蛋白-蛋白互作網絡圖

圖2 迷迭香酸（A）與氟西汀（B）PPI網絡的MCODE分析圖

2.3 化合物與關鍵靶點蛋白分子對接 利用AutoDockTools計算RA與關鍵靶點蛋白之間的最低結合能。結果顯示RA與15個關鍵靶點蛋白的結合能均＜-5.0 kcal/mol，說明RA與其治療的靶點具有良好的結合能力，并且與MMP2、MMP9、MAPK8、JAK2、EGFR、CASP3、AR、AKT1之間具有較強的結合活性，見表1。

表1 關鍵靶點蛋白與RA分子對接結果

2.4 基于GO功能注釋的分析和預測 通過DAVID在線平臺對兩種化合物治療抑郁癥的潛在靶點基因進行GO功能注釋（P＜0.05）。得到了RA相關條目一共1 342個，其中生物過程（biological process，BP）1 188個，細胞成分（cellular components，CC）46個，分子功能（molecular function，MF）108個；FLU相關條目共961個，BP、CC、MF分別為853、27、81個。根據P值對所得條目由小到大進行排序，篩選出每一類中前15位，并對前10位進行可視化處理，見圖3。結果表明，RA可能主要通過調節代謝過程的調控、對刺激的反應、信號傳導的調控、生化活性的調節等生物過程發揮作用。此外，在排位前15的條目中，RA和FLU都與代謝過程的正調控、信號轉導的調節、對有機物的反應、大分子代謝過程的正調控、細胞通訊調節、信號調節、細胞代謝過程的正調控、細胞對化學刺激的反應、神經元投射、受體結合、酶結合、相同的蛋白質結合、離子結合等有關。

圖3 迷迭香酸（A）和氟西汀（B）抗抑郁的GO富集分析

2.5 基于KEGG富集分析的分析和預測 為了探究RA用于治療抑郁癥潛在的信號通路，我們使用DAVID在線工具對兩種化合物治療抑郁癥的潛在靶點基因進行KEGGPathway富集分析（P＜0.05），得到RA潛在作用通路72條，FLU潛在作用通路22條。兩個化合物交集通路共11條，主要包括5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、ErbB信號通路（ErbB signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、神經營養因子信號通路（neurotrophin signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、間隙連接（gap junction）等通路。

此外，篩選RA和FLU富集得到的信號通路中包含靶點基因數最多的20條通路，并進行可視化處理（圖4）。結果表明，腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）等是RA獨有的治療抑郁癥的潛在信號通路。神經活性配體受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、cAMP信號通路（cAMPsignaling pathway）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、炎癥介質對TRP通道的調節（inflammatory mediator regulation of TRPchannels）等通路是FLU獨有的治療抑郁癥的潛在信號通路。

圖4 迷迭香酸（A）和氟西汀（B）抗抑郁的KEGG富集分析

3 討論

中醫認為抑郁癥屬于“郁證”范疇，多由情志不暢、氣機郁滯所致［13］，對于郁證的治療大多以疏肝理氣、調節脾胃、養血安神等為主［14］。RA是金粟蘭科植物草珊瑚［Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai］的指標性成分，而草珊瑚歸心經、肝經，具有祛風通絡、活血涼血的功效［7］，說明草珊瑚有可能通過疏肝理氣作用發揮抗抑郁作用。現代藥理研究也表明其具有抗炎、抗壓的作用［15］。而RA作為草珊瑚的有效成分，已被證明具有抗抑郁作用［16-17］，但其抗抑郁作用的許多關鍵機制還尚未明確。本研究通過網絡藥理學方法來探究RA和FLU抗抑郁作用的可能機制，為后續新藥研發以及聯合用藥治療抑郁癥提供依據。

通過在線網絡數據庫分別檢索了RA和FLU的潛在作用靶點和抑郁癥的作用靶點，結果表明，RA與抑郁癥的交集靶點比FLU多18個。對二者與抑郁癥的交集靶點進行PPI網絡分析，發現二者度值排名前15的交集靶點僅有IGF1一個靶點，說明RA與FLU可能共同作用于IGF1而發揮抗抑郁作用，且通過作用于不同的基因靶點而發揮抗抑郁作用，提示二者的抗抑郁作用機制可能存在較大差異。MCODE聚類分析進一步證明RA和FLU的抗抑郁作用于IGF1密切相關。通過GO功能注釋分析，我們發現RA和FLU治療抑郁癥過程都是多個生物過程、分子功能和細胞成分共同參與的結果，涉及到酶結合、蛋白受體結合、離子結合、多種代謝過程調節、信號傳導調節等分子功能，是一個多途徑協同調節的過程。KEGG分析結果也表明RA和FLU均可以通過5-羥色胺能突觸、ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路、神經營養因子信號通路、HIF-1信號通路等信號途徑發揮抗抑郁作用，說明RA與FLU可能作用于同一信號通路的不同靶點發揮作用。此外，在GO富集分析和KEGG富集分析預測的GO terms和信號通路中，RA得到的GO terms和潛在信號通路數量遠大于FLU，均說明RA的抗抑郁機制比FLU更加廣泛。

在RA的HUB基因中，RA已經被證明可以調節腦缺血大鼠AKT、CASP3的水平發揮抗炎、神經保護等作用［18］，以RA為主要成分的薄荷可以通過作用于MAPK1、MAPK8、PTGS2在束縛大鼠模型中發揮抗應激作用，并且與RA含量成正比［19］，說明RA可能作用于這些靶點發揮抗抑郁作用。雖然目前沒有關于RA在神經退行性疾病中與MMP9、MMP2、EGFR、CCL2、JAK2，但研究表明，這些靶點都參與了炎癥的發病機制，RA可以作用于MMP9、MMP2、EGFR而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力［20-21］。此外，目前沒有關于RA與SRC、IGF1、ESR1、AR、ERBB2的相關報道，而SRC與抑郁癥大鼠紋狀體神經元有著密切關系［22］，ERBB2也與嚙齒類動物紋狀體神經元興奮有關［23］。抑郁癥患者的IGF1水平高于健康人群，而IGF1又可以作用于大腦的IGF1受體發揮抗抑郁作用［24-25］。分子對接結果也驗證了RA與其關鍵靶點蛋白具有良好的結合能力，并且與MMP2、MMP9、MAPK8、JAK2、EGFR、CASP3、AR、AKT1之間具有較強的結合活性。與此一致，KEGG富集分析結果也表明RA可以通過腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路、雌激素信號通路、趨化因子信號通路等發揮抗抑郁作用。

FLU的HUB基因中，BDNF、CYP2D6、SLC6A4、MAOA與FLU的抗抑郁治療反應相關，可以參與到突觸可塑性調節、藥物分布、中樞5-HT和去甲腎上腺素的代謝和調節、神經遞質的傳遞等生物學過程［26］。AChE、HTR1A、HTR2A、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3單胺能神經傳遞相關，HTR1A、AChE、ADRA2A在抑郁動物模型FLU藥物反應有關，SLC6A2、SLC6A3是FLU治療抑郁的作用靶點［27-31］，HTR2A與FLU的治療反應無關。HTR1B啟動子區域的甲基化水平與FLU的臨床效果呈負相關［32］。FLU可以改善抑郁小鼠脊髓的IGF1表達水平［33］，還可以調節抑郁大鼠CASR表達水平，改善突觸可塑性［34］。FLU還可以作用于大鼠伏隔核的DRD2、DRD3發揮抗抑郁作用［35］。DRD4的多態性與抑郁癥相關［36］，OPRK1、OPRM1與嚙齒類動物的社交行為相關［37］，目前沒有FLU作用于這兩個靶點的報道。KEGG富集分析結果也表明FLU可以神經活性配體受體相互作用、鈣信號通路、多巴胺能突觸、cAMP信號通路等發揮抗抑郁作用。

綜上所述，RA的HUB基因主要通過調節氧化應激、炎癥、細胞凋亡等發揮抗抑郁作用，而FLU的HUB基因主要通過調節單胺能神經傳遞和突觸可塑性發揮抗抑郁作用。此外，已有研究表明RA可以作用于BDNF調節抑郁大鼠神經可塑性［38］，也可以調節大鼠多巴胺能神經傳遞發揮抗神經毒性作用［39］，進一步說明RA的抗抑郁機制比FLU更加廣泛。提示RA可能與FLU通過聯合用藥發揮更好的抗抑郁作用。