基于網絡藥理學與分子對接技術探討二陳湯調節絕經后骨質疏松癥脂骨代謝紊亂的藥效機制

張 欣，韓一旦，許云騰，王曉寧，嚴 輝，王 杰，李西海，4，王珊珊*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西結合學院，福建 福州 350122；3.中國科學院精密測量科學與技術創新研究院，湖北武漢430071；4.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是女性絕經后卵巢功能衰退、雌激素水平下降而引起的以骨髓脂肪化、骨質流失、骨微結構受損、骨強度降低為主要特征的代謝性疾病［1］。雌激素水平的下降不僅可以直接影響骨代謝，還可引起脂代謝異常與功能障礙，間接引起骨髓微循環障礙、骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨成脂分化失衡，進而降低骨代謝能力、促進骨丟失［2-3］。同時，脂代謝紊亂易導致脂肪細胞增多，誘發脂肪組織擴張，故PMOP脂骨代謝紊亂患者時常伴隨肥胖癥狀，而肥胖可通過多種作用機制對骨骼產生不利影響［4-6］。肥胖癥是PMOP脂骨代謝紊亂的常見并發癥，二陳湯對脂代謝紊亂具有較好的改善作用［7］，基于脂代謝異常以及肥胖癥對骨代謝產生的不利影響，推測二陳湯對脂代謝的調節作用可間接影響骨代謝，具備調節PMOP脂骨代謝紊亂、降低PMOP患者并發肥胖癥的概率，以延緩PMOP疾病發展進程、改善其臨床癥狀的潛力，但具體作用機制仍需進一步探索與驗證，故本文選取PMOP與肥胖癥的基因數據進行整合，應用網絡藥理學與分子對接技術從二陳湯的物質基礎出發，探究其調節PMOP脂骨代謝紊亂的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 PMOP與肥胖癥相關疾病靶點收集與整理 通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DRUGBANK（https：//www.drugbank.com/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、OMIM（https：//omim.org/）以及TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數據庫分別查找PMOP、肥胖癥的相關疾病靶點，其中Gene-Cards數據庫的Relevance score值越高則代表該靶點與疾病關系越密切，若靶點過多則可根據Relevance score值篩除相關性較小的靶點。利用R 4.0.3軟件將各數據庫所得靶點匯總后刪除重復項。

1.2 二陳湯有效成分及作用靶點收集與整理 在TCMSP中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分別檢索半夏、陳皮、茯苓、甘草四味藥的有效成分，并根據生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（druglikeness，DL）≥0.18篩選出具有較高活性的有效成分及其作用的蛋白質靶點。利用Uniprot蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org）對所有藥物靶點信息統一進行標準化，去重后即得二陳湯相關作用靶點。

1.3 蛋白互作網絡構建及拓撲分析 利用R 4.0.3軟件將篩選后的PMOP、肥胖癥疾病靶點與二陳湯藥物作用靶點取交集，得到二陳湯作用于PMOP與肥胖癥的共同靶點，將共同靶點提交至STRING 11.0（https：//www.string-db.org/）數據庫，生物種類選定“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（＞0.9），閾值越高，得到網絡的可信度越高，最后隱藏網絡中斷開連接的節點，其余設置不變，得到蛋白互作（protein-protein interaction network，PPI）網絡。然后使用Cytoscape 3.8.1軟件中的CytoNCA插件對所得PPI網絡進行拓撲分析，篩選核心靶點。計算PPI網絡中各節點的中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method centrality，LAC）、網絡中心性（network centrality，NC）等六項拓撲參數值，分析每個節點在PPI網絡中的重要性，取各項參數值均高于中位數值的節點，所得節點即為具有顯著意義的核心作用靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析 將二陳湯調節PMOP與肥胖癥的共同靶點輸入Metascape平臺，默認P＜0.01，對其生物學過程與信號通路進行聚類富集分析，并將所得數據結果利用Hiplot（https：//hiplot.com.cn）平臺進行可視化。

1.5 構建中藥復方調控網絡 運用Cytoscape 3.8.1軟件和Java代碼聯合分析構建二陳湯藥物有效成分作用于PMOP和肥胖癥共同靶點的調控網絡，即二陳湯調控網絡，從網絡中可以得到二陳湯作用于PMOP與肥胖癥共同的主要活性成分及作用靶點。

1.6 分子對接 使用Pubchem數據庫查找二陳湯主要活性成分的2D構象，用ChemOffice 14.0.0.117軟件轉換為3D結構并優化其最小自由能，使用PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）查找疾病靶點蛋白，并運用PyMOL 2.4.1軟件去除水分子和原有配體后加氫，然后將處理過的活性成分與靶點蛋白導入AutoDock 1.5.6，對接位點選擇以原有配體為中心，設置相應的網格箱（gird box）參數，運用Vina軟件進行分子對接，對接結果可用PyMOL軟件打開并查看圖像，一般認為結合能＜-5.0 kcal/mol時，說明活性成分與靶點蛋白具有較好的結合活性，而結合能＜-7.0 kcal/mol時具有強烈的結合活性［8］。

2 結果

2.1 PMOP與肥胖癥相關疾病靶點收集與整理結果 GeneCards數據庫獲得PMOP相關靶點1 099個，肥胖癥相關靶點9 166個，經過Relevance score值篩選后，得到PMOP相關靶點839個（Relevance score≥1）、肥胖癥相關靶點483個（Relevance score≥10）；OMIM數據庫獲得PMOP相關靶點10個，肥胖癥相關靶點28個；DRUGBANK數據庫獲得PMOP相關靶點101個，肥胖癥相關靶點63個；PharmGkb數據庫獲得PMOP相關靶點15個，肥胖癥相關靶點4個；TTD數據庫獲得PMOP相關靶點4個，肥胖癥相關靶點81個。將各數據庫PMOP和肥胖癥相關靶點取并集刪除重復值后，最終得到PMOP相關靶點918個，肥胖癥相關靶點563個。

2.2 二陳湯有效成分及作用靶點收集與整理結果 在TCMSP數據庫共篩得符合OB≥30%且DL≥0.18的半夏有效成分13個，靶點169個；陳皮有效成分5個，靶點95個；茯苓有效成分15個，靶點118個；甘草有效成分92個，靶點2506個，去重后共得到二陳湯有效成分107個，經Uniprot蛋白質數據庫標準化并去重后最終得到作用靶點233個。

2.3 PPI網絡構建及拓撲分析結果 通過R 4.0.3軟件得到PMOP、肥胖癥與二陳湯共同靶點48個，利用STRING數據庫，得到共同靶點的PPI蛋白互作網絡，除去無相互作用的節點后，網絡共顯示45個節點，148條邊（圖1），節點代表蛋白質，邊代表蛋白質-蛋白質關聯，邊的不同顏色表示蛋白質之間相互作用證據的不同類型。通過Cytoscape 3.8.1軟件中的CytoNCA插件對所得PPI網絡進行拓撲分析，結果顯示BC、CC、DC、EC、LAC、NC六項拓撲參數中位數值分別為18.069 230 6、0.686 167 945 5、25.5、0.159 415 334 5、19.268 065 265、21.716 469 98，其中拓撲參數值均大于中位數值的核心靶點共有15個，見表1，即二陳湯調節PMOP脂骨代謝紊亂的潛在核心靶點。

表1 PPI網絡拓撲分析參數

圖1 PPI網絡圖

2.4 GO和KEGG富集分析結果 GO富集及聚類分析結果顯示，滿足條件的生物過程（biological processes，BP）共585條，根據功能相似性分為20類，包括對脂多糖的反應、對細胞外刺激的反應、對無機物的反應、細胞遷移的積極調控、細胞對脂質的反應、活性氧代謝的反應、類固醇代謝過程、對雌二醇的反應等，其中細胞對脂質的反應、活性氧代謝過程、類固醇代謝過程、對雌二醇的反應與脂骨代謝具有明顯相關性；細胞成分（cellular components，CC）46條，根據功能相似性分為8類，包括膜筏、囊腔、網格蛋白包膜囊泡膜、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、小窩、內質網內腔、膜側和細胞器外膜等；分子功能（molecular function，MF）66條，根據功能相似性分為14類，包括血紅素結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、受體-配體活性、磷酸酶結合、伯胺氧化酶活性等，見圖2。KEGG富集及聚類分析結果顯示，滿足條件的信號通路共130條，根據功能相似性分為16類，其中較為重要的通路包括AGERAGE信號通路、IL-17信號通路、雌激素信號通路、脂肪細胞因子信號通路以及卵巢類固醇生成，見圖3。

圖2 GO富集分析圖

圖3 KEGG富集分析圖

2.5 中藥復方調控網絡結果分析 利用Cytoscape 3.8.1軟件構建二陳湯調控網絡并進行分析，見圖4。調控網絡總共包括148個節點（100個藥物活性成分節點、48個蛋白靶點節點）和468條邊，節點越大說明Degreed值越大，與之作用的活性成分越多，重要性越高，每條邊則表示有效成分與靶點之間的相互作用關系，Degreed≥60的蛋白靶點包括前列腺素內酯合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），見表2；Degreed≥10的活性成分包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）以及刺芒柄花素（formononetin），見表3。

表2 二陳湯作用的主要靶點基因網絡節點特征參數

表3 二陳湯主要活性成分網絡節點特征參數

圖4 二陳湯調控網絡圖

2.6 分子對接驗證結果 一般認為結合構象越穩定耗能越低，發生的作用可能性越大，將關鍵靶點與槲皮素、山奈酚、柚皮素以及刺芒柄花素進行分子對接，結果顯示，17個關鍵靶點結合能均小于-5.0 kcal/mol，說明二陳湯中的主要活性成分與疾病關鍵靶點有較強的結合能力，見表4。其中PPARG、PTGS2不僅是二陳湯調控網絡的主要靶點，同時還是PPI拓撲分析得出的核心靶點，ESR1是多條顯著性較高的生物進程與信號通路中的均含有的靶點基因，ESR1、PPARG、PTGS2與槲皮素、山奈酚、柚皮素以及刺芒柄花素的結合能力均＜-7.0 kcal/mol，見圖5。

圖5 ESR1、PTGS2、PPARG分子對接結果

表4 二陳湯主要活性成分與關鍵靶點的結合能分數（kcal/mol）

3 討論

中醫理論認為，脾與PMOP發生發展密切相關，李東垣《脾胃論·脾胃盛衰論》：“脾病……則骨乏無力……令人骨髓空虛，足不能履地。”脾為氣血生化之源，若脾失健運則無以濡養腎精，以致腎之主骨生髓功能失常，進而導致PMOP的發生［9］，脾失健運還可導致氣血運行不暢，水谷精微輸布失常，停聚日久而生痰濕，進而釀成膏脂，泛溢肌腠而成肥胖［10］，二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，陳皮理氣健脾，半夏化痰燥濕，茯苓健脾利濕，甘草補脾益氣、緩急止痛、調和諸藥，全方合用可益氣健脾、化痰利濕，痰消脾健則膏脂漸去、腎精得以濡養。二陳湯對脂代謝酶與脂質轉運蛋白的異常表達具有抑制作用，可改善脂肪因子的異常分泌，維持脂肪組織生理功能，減少脂質異位沉積，降低高密度脂蛋白、甘油三酯等脂肪因子對骨髓和骨代謝的不利影響［7，11-12］，由此推測，二陳湯可通過抑制脂代謝異常而間接影響骨代謝，從而達到調節PMOP脂骨代謝紊亂、改善PMOP臨床癥狀的作用，但其具體作用機制仍需進一步探索與證實。

本研究通過網絡藥理學方法初步篩選出二陳湯調治PMOP脂骨代謝紊亂的活性成分100個，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素以及刺芒柄花素作用的疾病靶點最多，且對脂、骨代謝均有一定的調節作用，故推測槲皮素、山柰酚、柚皮素以及刺芒柄花素可能是二陳湯調節PMOP脂骨代謝紊亂的主要活性成分。槲皮素可通過雌激素信號促進RUNT相關轉錄因子2（RUNX2）、堿性磷酸酶（ALP）表達，抑制PPARγ（PPARG）、CCAAT增強子結合蛋白α（C/EBPα）表達，從而促進BMSCs的成骨分化，抑制其成脂分化，槲皮素還可促進脂肪源性干細胞向成骨分化［13-14］。山奈酚能夠促進RUNX2、成骨細胞特異性轉錄因子（OSX）的表達，誘導BMSCs向成骨細胞分化、提高骨密度［15］，并通過調節增強子結合蛋白α、脂肪甘油三酯脂酶、激素敏感性脂肪的表達水平減少脂肪細胞中的脂質積累，調節其成脂分化［16］。柚皮素可通過抑制p38信號通路的表達進而抑制破骨細胞的生成［17］，降低去卵巢大鼠的骨轉換率，保持骨礦密度，改善骨小梁結構［18］，柚皮素還能夠降低血漿和脂肪中瘦素mRNA的表達水平，并下調脂肪組織中單核細胞趨化蛋白1（MCP1/CCl2）和白細胞介素-6（IL-6）mRNA的表達水平，減輕脂代謝紊亂［19］。刺芒柄花素可下調骨組織基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、IL-6 mRNA表達，同時上調磷酸化P38絲裂素活化蛋白激酶（P38MAPK）mRNA的表達，抑制破骨細胞骨吸收，增加骨密度［20］，還可作為PPARγ的激動劑，促進解偶聯蛋白1（UCP1）在脂肪細胞中的表達，通過調控白色脂肪細胞褐色化以調節脂代謝［21］。

已知女性絕經后雌激素水平的下降是PMOP脂骨代謝紊亂的主要因素，且本文通過二陳湯調控網絡的構建發現，ESR1的Degree值為79，是二陳湯活性成分作用的主要靶點之一，且在GO、KEGG富集分析結果顯示，顯著性較高的生物進程與信號通路中，細胞對脂質的反應、類固醇代謝過程、對雌二醇的反應以及雌激素信號通路中均含有ESR1。雌激素與ESR1結合后，可促進成骨細胞與免疫細胞分泌TNF-α、IL-1，并上調轉化生長因子β（TGFβ）的表達，從而抑制破骨細胞骨吸收活性，維持骨密度［22］，ESR1還可通過脂肪甘油三酯脂肪酶和圍脂滴蛋白調節脂滴大小從而調節脂質代謝［23］。PPARG與PTGS2不僅是二陳湯調控網絡中的主要靶點，同時還是PPI網絡中的核心靶點，PPARγ是BMSCs成脂分化關鍵轉錄因子［24］，PPARγ表達增加及活性增強均可促進BMSCs向成脂肪細胞分化，并抑制其向成骨細胞分化［25］。COX2（PTGS2）是前列腺素生物合成中的關鍵酶。COX2及其介導的前列腺素能夠促進白色脂肪和米色脂肪褐變，以增加能量消耗，減少脂質蓄積，改善脂代謝［26］。同時，感覺神經或骨細胞中皆含有COX2介導的前列腺素E2（PGE2），PGE2可通過激活前列腺素受體4（EP4）抑制中樞神經系統的交感活動，從而促進骨生成［27］。由此推測，ESR1、PPARG與PTGS2可能是二陳湯調節PMOP脂骨代謝紊亂的關鍵核心靶點，分子對接結果亦顯示ESR1、PPARG、PTGS2與二陳湯主要活性成分具有較強的結合活性。

GO和KEGG富集分析結果提示二陳湯可通過多種與內分泌、代謝以及免疫相關的生物進程和信號通路對PMOP脂骨代謝紊亂起到調節作用，生物進程主要包括細胞對脂質的反應、類固醇代謝過程、對雌二醇的反應、活性氧代謝過程，信號通路主要包括AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、雌激素信號通路、脂肪細胞因子信號通路和卵巢類固醇生成。RAGE是晚期糖基化終產物（AGEs）的受體，AGEs與RAGE相互作用后，可激活Caspase-3信號通路，誘導成骨細胞凋亡，增加細胞內活性氧的產生，抑制MAPK、ALP活性，促進骨吸收［28］，AGEs還可抑制BMSCs增值，并通過Wnt/β-catenin信號通路抑制其向成骨分化［29］。ERα不僅可刺激骨細胞產生NO和PGE2，影響破骨細胞和成骨細胞的形成［30］，還可與雌二醇結合減小脂肪細胞的體積，迅速降低骨髓脂肪量［31］。IL-17A與TNF-α協同作用，可抑制Wnt信號通路促進BMSCs向成骨細胞分化以及成骨細胞礦化，亦可激活PEG2，從而抑制PPARγ、脂聯素等的表達以減少BMSCs向脂肪細胞分化［32-33］，故推測二陳湯可通過抑制AGE-RAGE信號通路或促進IL-17信號通路、雌激素信號通路的表達，抑制BMSCs的成脂分化，從而促進其成骨分化，達到調節PMOP脂骨代謝紊亂的作用。

本研究發現，二陳湯含有的主要活性成分以及作用的多個核心靶點與通路可對BMSCs增殖分化產生影響，女性絕經后BMSCs傾向于分化為脂肪細胞，其成骨分化以及骨形成受到明顯抑制，當大量BMSCs分化為脂肪細胞時，成骨細胞的數量會相應減少，導致PMOP的發生［34-35］。故推測二陳湯對BMSCs成脂分化具有抑制作用，從而在一定程度上提升成骨分化能力，恢復脂骨代謝平衡。

綜上所述，本文基于PMOM與肥胖癥相關的共同靶點基因，揭示了二陳湯通過多成分、多靶點、多通路調節PMOP脂骨代謝紊亂的藥效機制，其作用機制可能是通過抑制BMSCs的成脂分化、減少脂質的積累進而緩解脂代謝紊亂對骨代謝產生的影響，從而延緩PMOP疾病發展進程、改善PMOP臨床癥狀。但因本實驗結果是基于生物信息學方法，僅通過大量數據計算推測所得，有一定的局限性，故后續仍需通過動物、細胞實驗進行進一步探索與驗證。