2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸血癥對陰莖海綿體內(nèi)鈣敏感受體的影響

秦文波 遲寶進(jìn) 姜大力 何昊麟 陳大印 張 鵬 李加彬

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154002)

全球約有1億多勃起功能障礙(ED)患者，在40～70歲的男性中，約有52%的男性有不同程度的ED〔1〕。糖尿病、心血管疾病、抑郁癥等是勃起功能障礙的重要危險因素〔2～4〕，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全清楚，也缺少理想的治療手段。因此，本實驗主要探討2型糖尿病(T2DM)大鼠陰莖海綿體鈣敏感受體(CaSR)變化。

1 材料與方法

1.1 T2DM型ED動物模型的建立 選用雄性Wistar大鼠50只，體重150～200 g，動物及飼料由佳木斯大學(xué)動物室提供。經(jīng)檢測每只大鼠性功能均正常，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)取10只為正常對照組，余40只給予高糖高脂飲食4 w后，禁食8 h，按25 mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)，復(fù)制T2DM動物模型，第4天割尾取血檢測外周血血糖，血糖 ＞16.67 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重減輕即確定 DM模型復(fù)制成功。注射STZ4 w后，將T2DM大鼠分組放在玻璃罐中，然后在大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡 80 μg/kg，觀察60 min，在此期間記錄陰莖有無勃起，陰莖無勃起大鼠為成功成模。將造模成功大鼠隨機(jī)分成三組:T2DM模型組，胰島素治療組，葉酸治療組。

1.2 ED實驗 分別于4 w和8 w兩個時間點進(jìn)行ED實驗，每只大鼠在頸項背部皮下注射阿撲嗎啡100 μg/kg。每只注射后觀察60 min，并予以記錄陰莖有無勃起和有無打呵欠。龜頭充血或陰莖體勃起成角大于90度為勃起1次。

1.3 血中總同型半胱氨酸含量(Hcy)測定 各組大鼠于16 w后，尾靜脈采血，分離血漿，采用酶聯(lián)免疫法測定血中 Hcy含量。

1.4 激光共聚焦檢測(LSCM)陰莖海綿體CaSR的表達(dá)情況解剖顯微鏡下仔細(xì)分離大鼠陰莖，獲得陰莖球海綿體平滑肌。常規(guī)制備石蠟切片(3 μm)，將玻片放入60℃烤箱中，烤干備用。將玻片烘干，抗原修復(fù)，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃冰箱過夜加上山羊抗兔FITC熒光二抗(稀釋度1∶50)，加上PI做細(xì)胞核的熒光標(biāo)記(稀釋度1∶1000)。用甘油進(jìn)行封片，在激光共聚焦顯微鏡下拍照，各組隨機(jī)選取2個部位，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量積分光密度(IOD)值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析SNK-q檢驗，χ2及Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù) 與正常對照組相比，T2DM模型組大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度明顯升高(P＜0.05);T2DM模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。與T2DM模型組相比，胰島素治療組和葉酸治療組大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度明顯降低(P＜0.05);治療后二組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯增加(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù)比較(n=10，±s)

表1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù)比較(n=10，±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，與T2DM模型組比較:2)P＜0.05

陰莖勃22.72±1.688.67±2.091.93±0.71 T2DM模型組 51.60±3.461)23.91±2.311) 0.17±0.111)胰島素治療組 24.94±1.112)18.05±0.482) 0.32±0.632)葉酸治療組 23.48±1.622)17.69±1.272) 0.29±0.612)起次數(shù)正常對照組分組 胰島素(mmol/L)Hcy(μmol/L)

2.2 大鼠陰莖海綿體平滑肌CaSR的表達(dá) T2DM模型組和葉酸治療組大鼠的海綿體平滑肌中 CaSR表達(dá)〔(51896±8643)和(4269±6937)〕與正常對照組〔(34524±4985)〕比較均明顯增多(P＜0.05)，胰島素治療組(40636±9957)CaSR表達(dá)明顯少于T2DM模型組(P＜0.05)，與葉酸治療組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

圖1 各組大鼠陰莖海綿體CaSR表達(dá)

3 討論

T2DM早期多無胰島β細(xì)胞功能減損，因此患者血清胰島素水平接近正常或偏高，但血中胰島素不能有效地控制血糖水平，表現(xiàn)為糖耐量異常;患者常出現(xiàn)靶組織對胰島素反應(yīng)不敏感甚至出現(xiàn)胰島素抵抗的臨床狀態(tài);T2DM患者常伴有肥胖、高血壓、血脂異常，這些因素恰是心血管疾病的高危因素。在實驗中選用Wistar大鼠建立T2DM動物模型，先通過尾靜脈注射STZ造成糖耐量異常，再喂以高熱量飲食誘發(fā)動物肥胖，持續(xù)喂養(yǎng)10 w后檢測血清胰島素水平升高，這與人的T2DM理生理改變相類似。此方法與實驗性糖尿病動物模型建立的相關(guān)研究一致〔5，6〕，在研究T2DM方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。

研究表明高蛋白，高糖飲食可以引起高Hcy血癥。而高Hcy是心血管疾病的獨立致病因素之一。Hcy能使細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基具有細(xì)胞毒性作用，并可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生，使血管硬化，促使內(nèi)皮小血栓形成。誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥樣硬化。而作為動脈系統(tǒng)終末部分的海綿體動脈同樣也會受累，進(jìn)而導(dǎo)致ED〔7〕，這就說明高Hcy對心血管的致病作用也是ED的致病因素之一。經(jīng)過阿撲嗎啡試驗而證明模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯減少。即血漿Hcy濃度增高，大鼠陰莖勃起功能下降。前期研究證明〔8〕，電鏡顯示睪丸精原細(xì)胞線粒體呈空泡樣變，嵴結(jié)構(gòu)模糊甚至消失，線粒體的這些改變使其正常供能受到破壞，從而使精子發(fā)生終止于精母細(xì)胞和精子細(xì)胞階段，導(dǎo)致管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。附睪主細(xì)胞表面絨毛脫落，腔內(nèi)精子數(shù)量減少及光鏡下陰莖平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，纖維結(jié)締組織密度增加均表明糖尿病時，睪丸、附睪及陰莖的病理改變可能是造成生精功能障礙及ED的原因。

本研究采用LSCM檢測發(fā)現(xiàn)模型組CaSR蛋白表達(dá)明顯增加，提示CaSR的表達(dá)增加參與了ED的發(fā)生。CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。CaSR主要分布在參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的甲狀旁腺、腎腸道、骨組織和腎組織以及其他細(xì)胞(中樞和外周神經(jīng)、肝臟、血細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞等)，其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，尚可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等。CaSR的配體主要是細(xì)胞外 Ca2+，Mg2+、Gd3+、新霉素、精胺等多價陽離子亦是CaSR的激動劑。CaSR可通過激活MAPKs(包括p38 MAPK，JNK和ERK)-細(xì)胞色素C-Caspase-3通路及 Fas受體死亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9，10〕。前期研究還表明，NO和CO系統(tǒng)與鈣通道相關(guān)性在ED發(fā)生發(fā)展中的作用〔11～13〕，本研究發(fā)現(xiàn)CaSR在大鼠陰莖海綿體平滑肌有表達(dá)，且在T2DM大鼠，陰莖海綿體平滑肌CaSR的表達(dá)異常。

研究表明，ED時鈣庫操縱性陽離子通道和受體操縱性陽離子通道在陰莖動脈平滑肌表達(dá)上調(diào)，可能是ED的一個新機(jī)制〔14，15〕。鑒于CaSR普遍在機(jī)體各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞中有表達(dá)，而且CaSR引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高的機(jī)制也是通過鈣庫操縱性鈣通道(SOCC)和受體操縱性鈣通道(ROCC)，因此，推測CaSR在陰莖平滑肌細(xì)胞有功能表達(dá)，并可能參與ED的發(fā)生。

綜上，本研究首次證明了，大鼠陰莖海綿體平滑肌有CaSR表達(dá)，T2DM誘導(dǎo)的CaSR表達(dá)增加在T2DM血管病變中發(fā)揮重要的作用，這也可能是T2DM大鼠ED的原因之一，其機(jī)制與CaSR介導(dǎo)的Ca2+增加有關(guān)，具體作用機(jī)制和信號途徑有待于進(jìn)一步研究。

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