姜黃素及谷胱甘肽對阿霉素所致大鼠急性心肌損傷的保護作用

盧均坤 呂維娟 劉 洋 王燕琴 (佳木斯大學附屬第一醫院心內科，黑龍江 佳木斯 54002)

蒽環類抗生素是有效的抗腫瘤藥物，然而會對正常的組織造成損害。尤其是劑量依賴性的急性和延遲心肌損傷，在心肌損傷的病人中約有20%可引起充血性心力衰竭〔1〕。核轉錄因子-κB(NF-κB)廣泛地調控著一系列基因的表達，尤其是調節參與免疫反應、應激反應、炎癥反應和凋亡等相關因子的基因表達〔2〕。姜黃素是一種天然的NF-κB抑制劑，能夠保護間充質干細胞免受炎性細胞因子損害，姜黃素具有抑制多種炎癥因子的作用，谷胱甘肽可通過一些酶系，抑制脂質過氧化作用的啟動和終止脂質過氧化的發展，從而阻斷新自由基的產生〔3〕。本實驗探索阿霉素心肌損傷的機制及預防機制。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 健康12 w齡左右Wistar大鼠60只，雌雄不限，體重(250±28)g，由佳木斯大學實驗動物中心提供〔許可證號為SCXK(黑)2007－0001〕。阿霉素由浙江海正藥業有限公司生產，姜黃素由陜西森弗生物技術有限公司;谷胱甘肽購自上海復旦復華藥業有限公司;心肌酶檢測試劑盒、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組 60只Wistar大鼠，隨機分為三組，每組20只，設空白對照組正常飼喂，腹腔注射等量生理鹽水。實驗組，按照1.25 mg/kg劑量腹腔注射阿霉素，隔日一次共計7次，累積劑量7.5 mg/kg。姜黃素谷胱甘肽干預組，阿霉素腹腔給藥同實驗組，但在化療前4 d開始給予姜黃素及谷胱甘肽鼠尾靜脈給予，每日一次，直到化療結束。

1.3 標本收集 所有實驗大鼠，實驗結束后摘除眼球方法取血，在4℃，3000 r/min離心后取上清液，備用。留取大鼠左心室心臟標本2%戊二醛及4%本甲醛固定，備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 一般情況檢測 觀察大鼠的一般精神狀況，飲食，皮毛和體重情況等。

1.4.2 血清心肌酶檢測 酶聯免疫吸附法測定，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 組織病理學檢查 心肌組織4%甲醛固定24 h后以石蠟包埋，切成5 μm左右薄片，用HE進行染色，顯微鏡觀察心肌組織病變，以腫脹肥大程度及胞質空泡變性程度來判定。

1.4.4 電鏡檢查 取左心室心肌部組織，2%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，Epon812包埋、切片至70～80 nm，鉛鈾電子染色，電鏡觀察線粒體結構。

1.4.5 免疫組化檢查 NF-κB、IκB均采用按試劑盒說明書進行操作:取4 μm厚10%甲醛固定的石蠟切片，常規脫蠟水化，浸入3%過氧化氫(H2O2)5 min，PBS沖洗3次，滴加稀釋的一抗(NF-κB P65單克隆抗體和IκBα多克隆抗體均為 1∶50稀釋度)，滴加適量兔抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，DAB顯色。乙醇脫水，透明樹膠封片。心肌間質細胞及細胞核內染色強度評分:未著色、淺黃色、黃色、棕黃色分別計為0、1、2、3分;陽性細胞數為 ＞25%、25% ～50%、50% ～75%、＞75%分別計為0、1、2、3分;兩者之和 ＞2即為免疫組化陽性，計算陽性百分率。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀況 空白對照組大鼠攝食、活動、糞便等一般狀況良好，體重增長較快，皮毛光滑;阿霉素組大鼠出現進食明顯減少、腹瀉，活動遲緩、體重增長緩慢、皮毛不光滑;姜黃素谷胱甘肽干預組較阿霉素組大鼠進食量增多，活動性較好，體重增長稍慢，皮毛不光滑。

2.2 心肌酶學變化 在三組大鼠中，阿霉素組血清心肌酶各指標明顯高于空白對照組及姜黃素谷胱甘肽組(P＜0.05)，姜黃素谷胱甘肽組同空白對照組比較差異無顯著意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 心肌組織結構的病理學檢查 空白對照組:心肌組織未見明顯變性;阿霉素組:心肌組織結構紊亂，部分心肌細胞肥大腫脹明顯，細胞內可見均勻的細小紅染顆粒，并伴有水樣變性;姜黃素及谷胱甘肽干預組:心肌組織少部分心肌細胞腫脹肥大，細胞輕度水樣變性，見圖1。

表1 各組大鼠血清心肌酶學變化(±s，n=20)

表1 各組大鼠血清心肌酶學變化(±s，n=20)

與阿霉素組比較:1)P＜0.05

組別 CK(U/L) CK-MB(U/L) TnI(μg/L) LDH(U/L) AST(U/L).5437.5±32.8阿霉素組 768.6±137.5889.2±147.50.82±0.071 473.6±334.5815.4±102.4姜黃素谷胱甘肽組 523.7±131.81) 584.3±135.41) 0.41±0.061) 936.8±137.21) 523.6±95.71)空白對照組 467.4±124.3526.3±137.60.36±0.04842.3±94

2.4 線粒體電鏡檢查 電鏡檢查發現空白對照組大鼠心肌線粒體排列整齊、皺褶比較多、峭完整;阿霉素組大鼠心肌線粒體增生、排列紊亂、腫脹、畸形，峭減少、肌漿網擴張、空泡化明顯;姜黃素谷胱甘肽干預組大鼠心肌線粒體增生、排列紊亂、腫脹程度較單純阿霉素明顯減輕、嵴較單純阿霉素組增多、有少量空泡變性，見圖2。

2.5 免疫組化檢查 在各組大鼠心臟組織中NF-κB蛋白的表達與IκB蛋白的表達的相關分析發現，空白對照組大鼠心肌細胞有少量NF-κB蛋白表達和較多IκB蛋白表達;阿霉素組大鼠中NF-κB蛋白表達陽性率明顯升高，IκB蛋白表達明顯下降;在姜黃素谷胱甘肽組表達較阿霉素組NF-IκB蛋白表達明顯降低、IκB蛋白顯著增加(P＜0.05)，同空白對照組比較差別無顯著意義(P＞0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學檢查(HE，×200)

圖2 各組大鼠心肌線粒體電鏡檢查(×9000)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表達(%，±s，n=20)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表達(%，±s，n=20)

與阿霉素組比較:1)P＜0.05

組別 NF-κB IκB 6.06±0.4842.08±6.26阿霉素組 47.34±1.0511.29±1.17姜黃素谷胱甘肽組 12.17±0.541) 35.23±7.041)空白對照組

3 討論

蒽環類藥物屬于抗生素類藥物，抑制惡性腫瘤的作用是通過插入DNA雙鏈、抑制拓撲異構酶Ⅱ和細胞凋亡的方式起作用的〔4〕。在臨床治療中重復使用蒽環類藥物會導致頑固性心律失常，心臟擴大，頑固性心力衰竭，傳統的抗心衰治療往往無效，嚴重地影響到腫瘤患者的5年生存率和生活質量，從而限制了蒽環類藥物在臨床的廣泛使用。

姜黃素是植物姜黃提取的酚類化合物，經常被用作調味品及食物染色劑，研究發現姜黃素具有抗炎抗氧化作用〔5〕，同時姜黃素具有抗腫瘤作用，可使癌細胞凋亡。阿霉素具有強大的誘生自由基作用，通過電子與氧分子結合形成活性氧，減少NADH脫氫酶，形成半鯤結構化合物，促使心肌線粒體氧化還原反應，正常情況下，人體可以通過超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)和GSH及時清除或還原自由基及其超氧化物，這些酶在清除自由基、抗脂質過氧化中具有重要作用。而阿霉素可使這些酶減少，活性降低〔6〕。GSH通過一些酶系抑制脂質過氧化作用的啟動和終止脂質過氧化的發展，從而阻斷新自由基的產生。姜黃素聯合谷胱甘肽干預大鼠阿霉素心肌損傷具有顯著作用，線粒體變性可能是阿霉素心肌損害的始動因素，有待于進一步研究。

有研究表明阿霉素心肌毒性早期引起線粒體超氧化反應和其他活性氧的產生，通過一系列氧化還原反應產生NO和活性氮，隨后引起NF-κB和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達增加〔7〕，阿霉素還可通過上調氧化還原敏感的轉錄因子如p53和NF-κB，改變了心肌線粒體通透性，增加心肌細胞凋亡，最終引起心臟毒性。在本實驗中說明阿霉素引起NF-k表達增加，NF-κB是由p50和p65亞基組成的異源二聚體，正常情況下它在胞質中與其抑制蛋白IκB結合而呈非活性狀態。當細胞受到各種刺激原作用時，NF-κB與其抑制蛋白IκB解離而激活，進入細胞核內與特定基因啟動子結合，調節靶基因表達。近年研究發現，iNOS基因5'端轉錄調控區域中含有NF-κB結合位點，NF-κB激活參與iNOS mRNA表達〔8〕，iNOS和NO過氧化反應是阿霉素心臟毒性及心肌細胞凋亡的觸發點和介質，當細胞受到各種刺激后，NF-κB即被活化，并很快異位到核與靶基因啟動子區域κB基序結合，啟動基因的轉錄和蛋白合成，調節基因的表達。徐浩等〔9〕研究表明，NF-κB在阿霉素致大鼠心肌組織細胞損傷過程中起促進細胞凋亡的作用，可能與其調節凋亡相關基因p53的表達有關。Buhrmann等〔10〕研究發現發現，在體外培養的跟腱細胞感染模型中，姜黃素能通過抑制IκBα磷酸化及降解，抑制在IL-1β誘導的NF-κB激活。本研究結果顯示，在正常大鼠心肌組織中NF-κB有少量表達，可能是正常心肌組織NF-κB維持正常的心肌生理功能，調節正常心肌組織。姜黃素、谷胱甘肽對人體沒有毒性作用，可以用來保護惡性腫瘤病人在應用阿霉素化療時，減輕心臟損害。

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9 徐 浩，李紅莉，周國偉，等.核因子-KB在阿霉素致大鼠心肌細胞損傷中的意義〔J〕.實用診斷與治療雜志，2008;22(4):258-63.

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