雷帕霉素對肝臟缺血再灌注大鼠Beclin-1、Lc-3蛋白表達及細胞凋亡的影響

王國強 劉洪珍 楊承祥 文先杰 趙偉成

(江蘇省麻醉學重點實驗室 江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室，江蘇 蘇州 221004)

雷帕霉素(RAPA)是一類新型免疫抑制劑，可提高移植物的長期存活率。目前研究發現，RAPA可激活自噬系統，抑制腎小管上皮細胞再生，延遲移植腎功能恢復時間等〔1，2〕。但RAPA減輕肝臟缺血再灌注損傷的研究相對較少。本文擬探究RAPA是否能夠減緩肝臟缺血再灌注后肝細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康清潔型SD大鼠(雌雄不限)36只，體質量200～220 g(購自江蘇省麻醉學重點實驗室)，適應性喂養1 w后開始試驗。將大鼠隨機分為假手術組(A組)、手術組(B組)和雷帕霉素組(C組)。

1.2 建立動物模型〔3〕術前6～8 h禁食，自由飲水，A組行麻醉、剖腹，解剖肝門，不阻斷血供。B組在A組基礎上，分離左、中肝葉各韌帶，使肝臟充分暴露，使左、中肝葉的膽管及門靜脈、肝動脈分支游離。用血管夾鉗夾后造成左、中葉肝臟缺血，麻醉后夾閉大鼠左半肝血供90 min，被阻斷區肝葉由鮮紅變為暗紅判定肝臟缺血成功，恢復血供后再灌注60 min，造成肝臟缺血再灌注模型。C組同樣行A組步驟后，在肝臟缺血前5 min經腸系膜上靜脈緩慢注射治療劑量RAPA 5 mg/kg(A組和B組緩注等劑量的生理鹽水)。各組均于再灌注3、6、12、15 h后，取大鼠尾靜脈血檢測肝臟功能的變化，并取缺血肝葉標本，設定再灌注后0、3、6、12 h為檢測結點，每次檢測3只，固定于甲醛溶液用于病理學檢測。

1.3 檢測指標 Beclin-1、Lc-3蛋白表達:取各組肝臟組織，應用Beclin-1鼠抗人試劑盒、Lc-3兔抗人多克隆抗體試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，按試劑盒說明操作，采用PV法進行檢測;請2位高年資病理科醫師閱片。Beclin-1蛋白多為細胞質內表達，Lc-3蛋白僅在細胞質內表達。血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)含量用常規生化方法檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件。計量資料以±s表示，組間比較應用方差分析。

2 結果

2.1 各組Beclin-1、Lc-3蛋白表達情況 Beclin-1蛋白表達高峰為缺血再灌注后3 h，Lc-3峰值為缺血再灌注后6 h，見表1。2.2 各組ALT、AST變化情況 ALT、AST峰值時間均在缺血再灌注后12 h，見表2。

表1 各組Beclin-1、Lc-3蛋白表達陽性率(%，n=3)

表2 各組ALT、AST變化情況(±s，n=3，IU/L)

表2 各組ALT、AST變化情況(±s，n=3，IU/L)

與同組不同時段比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

組別ALT AST 3 h 6 h 12 h 15 h A組 42.34±4.3182.34±4.77119.34±5.3579.34±8.29101.22±3.41180.66±8.38221.13±2.72182.3 h 6 h 12 h 15 h 41±5.91 B組 139.37±5.83147.64±2.99258.38±9.211) 150.38±8.14457.20±5.33527.20±9.01599.20±3.521) 511.42±6.46 C組 56.32±5.2498.02±7.1999.02±7.191)2) 99.01±6.88302.45±1.92355.91±5.55371.22±8.361)2)331.71±9.83

3 討論

肝臟缺血再灌注涉及肝臟創傷手術修復、器官移植、移植后功能恢復等諸多問題，一直以來都是人們研究的熱點〔4〕。血清ALT和AST水平是反映肝損傷程度最為靈敏的指標〔5〕。隨著人們研究的不斷深入，RAPA與細胞自噬對肝臟缺血再灌注損傷的相關研究開始進入人們的視野。目前已知Lc-3和Beclin-1均為自噬相關基因，可參與自噬體形成，其中Lc-3已作為檢測自噬活性的標記性分子〔6〕。

本研究結果證實，缺血再灌注會對肝臟造成一定程度的損傷，而RAPA對肝臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，與徐倩等〔7〕的研究結果相似。

綜上，RAPA可有效改善肝缺血再灌注損傷，但其確切機制有待更深入研究。

1 余 曦，張 瑩，范 偉，等.雷帕霉素對肝臟缺血再灌注中線粒體DNA損傷及修復機制的影響〔J〕.第三軍醫大學學報，2014;31(21):2191-5.

2 肖堂利，孫 蕾，管 旭，等.雷帕霉素對糖尿病腎病小鼠足細胞自噬的改善作用〔J〕.第三軍醫大學學報，2013;30(23):2530-5.

3 陳廣順，司中洲，李杰群，等.雷帕霉素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.西安交通大學學報(醫學版)，2014;1(1):85-8.

4 Afzal M，Intelligent I，Kaur P，et al.Comparison protective and curative potential of daucus carol root extract on plans expertise ischemia reperfusion injury in rats〔J〕.Pharm Biol，2013;51(7):856-62.

5 元文勇，余偉平，葉啟發，等.大鼠肝臟缺血再灌注損傷程度判定指標的選擇〔J〕.中國普通外科雜志，2008;17(7):650-3.

6 眭怡群，馮一中.自噬相關基因 LC3、Beclin-1與凋亡相關基因 p53、BCL-2在大腸癌中的表達及意義〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2012;28(3):392-401.

7 徐 倩，杜洪印，喻文立，等.雷帕霉素對大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.天津醫科大學學報，2014;(3):181-3.