慢性溫和應激后老年大鼠抑郁癥狀及HSP70的變化

鐘靜玫 郭 強 陳 輝 趙乃偉 趙 忠 (云南省第一人民醫院臨床心理科，云南 昆明 650032)

抑郁癥是常見多發病，而老年期的抑郁癥發病率尤高，達到36.8%〔1〕。抑郁癥發病機制目前尚未完全清楚，目前有觀點認為心理應激與抑郁易損基因的相互作用，導致的氧化應激、神經細胞凋亡、神經可塑性改變與抑郁癥有關〔2〕。老年期存在應激應答能力、抗氧化、抗凋亡能力及神經重塑能力的改變〔3〕。而熱休克蛋白70(HSP70)是一種應激應答蛋白，具有抗氧化、抗凋亡，增加神經元可塑性的作用〔2〕。本研究旨在了解老年大鼠在慢性溫和應激的作用下，HSP70水平的改變及其對抑郁癥狀的影響。

1 資料與方法

1.1 動物與分組 老年期大鼠為SPF16月鼠齡SD雄性大鼠12只，體重460～575 g，按體重隨機分為兩組，各6只一組接受Western印跡和RT-PCR檢測，另一組接受免疫組化檢測;對照組為SPF標準3月鼠齡的SD雄性大鼠12只，體重180～220 g，按體重隨機分為兩組，各6織一組接受Western印跡和RT-PCR檢測，另一組接受免疫組化檢測。大鼠購自四川省簡陽達碩動物科技有限公司，動物合格證號0023237，許可證號:SCXKL 11122008-74。適應性喂養1 w，鼠舍溫度(21±1)℃，濕度40% ～60%，12 h光照與黑暗循環，早8點亮燈，20點熄燈，能夠自由地接近食物與水，一鼠一籠。適應性喂養第4、5天，給予每籠1%蔗糖水。第6、7天，給予每籠1%蔗糖水和純凈水各一瓶。第8天開始進行慢性溫和應激，應激前后分別進行抑郁癥狀行為學檢測。行為學檢測完成后，將大鼠用無巴比妥(60 mg/kg)麻醉。對進行Western印跡、RT-PCR檢測的大鼠斷頸取腦，分別取出大鼠海馬與額葉，經液氮固定后放置于－80℃冰箱凍存備用。對進行免疫組化的大鼠，采用4%的多聚甲醛內固定，剝取全腦后用4%的多聚甲醛外固定。外固定后48 h，經梯度脫水，石蠟包埋，行冠狀切片，片厚5 μm。

1.2 抑郁癥狀行為學檢測 ①糖水偏好實驗:第8天8點開始禁飲禁食24 h，次日8點每籠給予1%蔗糖水和純凈水各一瓶，喂養1 h。喂養前后分別將1%蔗糖水和純凈水稱重，前后水量的差值為消耗量，計算出1%蔗糖水在總消耗量中的百分比，為糖水偏好程度。于3 w慢性溫和應激的最后1 d 8點禁飲禁食24 h，次日8點再次進行糖水偏好實驗，檢測糖水偏好程度。首次糖水偏好程度減去末次糖水偏好程度，為糖水偏好程度下降值。②敞箱實驗:糖水偏好實驗后進行敞箱實驗。將每只大鼠放入敞箱中央格，開始計時2 min，分別計數垂直運動指數、水平運動指數、中央格停留時間。垂直運動指數為前腿抬離地面的次數;水平運動指數為四肢離開1個正方形小格的次數;中央格停留時間為從計時到四肢離開中央格的時間。

1.3 慢性溫和應激 慢性溫和應激的內容包括:禁飲禁食24 h(8∶00 ～ 次日 8∶00)，限制 1 h(8∶00 ～9∶00)，旋轉鼠籠30 min(8∶00 ～8∶30)，鼠籠傾斜12 h(8∶00 ～20∶00)，同性入侵24 h(8∶00 ～ 次日8∶00)，濕籠12 h(8∶00 ～20∶00)，晝顛倒12 h(8∶00 ～20∶00)，夜顛倒12 h(20∶00 ～8∶00)。每周隨機安排每天的慢性溫和應激內容，持續3 w。

1.4 Western印跡 首先進行蛋白的提取，將少量組織塊置于勻漿器中，加400 μl單去污劑裂解液裂(含 PMSF)于勻漿器中，重復碾壓組織盡量碾碎，裂解30 min后將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。然后進行蛋白定量。隨后進行SDS-PAGE電泳，配10%分離膠，加入 TEMED后立即搖勻即可灌膠;配4%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠;計算含20 μg蛋白的溶液體積即為上樣量;取出上樣樣品至200 μl的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1倍。將樣品置于熱變性裝置中5 min使蛋白變性;加足夠的電泳液后開始上樣;電泳45 min。轉膜至PVDF膜上75 min。10%脫脂奶封膜，4℃過夜。TPBS洗膜，標一抗，抗HSP70單克隆抗體及抗β-actin(Cruz Co.)。TPBS洗膜，標二抗。再洗膜，最后化學發光，顯影，定影。以HSP70與β-actin條帶光密度的比值表示HSP70蛋白的相對水平。

1.5 RT-PCR 將組織剪碎，液氮研磨后，Trizol法提取總RNA，并經完整濃度、純度測定，符合實驗室要求。根據Gen-Bank中HSP70與β-actin mRNA序列設計特異性引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。HSP70正義引物為5＇-GCTGGTGAGCCACTTCGTG-3＇，反義引物為 5 ＇-TGGATCTGCGCCTTGTCC-3＇，擴增產物為288 bp。β-actin 正義引物為5＇-CACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3 ＇，反 義 引 物 為 5 ＇-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3＇，β-actin PCR擴增產物為400 bp。PCR反應體系為:5 μl cDNA，14.5 μl 2 × Taq PCR MasterMix，3.5 μl H2O，上下游引物各1 μl。HSP70反應條件:94℃預變性2 min;94℃3min;56℃ 30 s，72℃ 45 s，29 個循環;72℃延伸10 min。β-actin反應條件:94℃預變性5 min;94℃ 30 S;59℃ 1 min，72℃ 1 min，28個循環;72℃延伸10 min。PCR產物由2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以 HSP70與 β-actin條帶光密度的比值表示HSP70 mRNA的相對表達量。

1.6 免疫組化 石蠟切片常規脫蠟;微波抗原修復20 min;滴加山羊血清，室溫下15 min;滴加兔抗鼠HSP70單克隆抗體(濃度1∶100，Santa Cruz Co.)，4℃過夜;以非免疫血清代替一抗作為陰性對照，用DAKO公司的EnVisionTM法檢測12例組織標本，按說明操作，DAB顯色。免疫組化結果判斷:以細胞質(或細胞核/細胞膜，根據每個抗體不同)中出現棕黃色顆粒為染色陽性，分別在至少有5個代表性的高倍視野計數500個細胞中的陽性細胞數。染色結果綜合染色強度及陽性細胞數量兩個方面進行半定量分析，分別評分。染色強度:陰性(0分)，淺黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色3分;陽性細胞數計分:無著色細胞為0分，陽性細胞數占5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76%以上為4分。根據兩項結果相加分數判斷結果:0～1分(－)，2～3分(+)，4～5分()，6～7分()。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結果

2.1 慢性溫和應激前后行為學檢測 老年組大鼠糖水偏好程度的下降明顯大于青年組;老年組垂直運動指數、水平運動指數、中央格停留時間均低于青年組(P＜0.05)。見表1。

表1 慢性溫和應激前后行為學指標比較(±s，n=6)

表1 慢性溫和應激前后行為學指標比較(±s，n=6)

組別 糖水偏好試驗(%)垂直運動指數(次)水平運動指數(次)中央格停留時間(s)39.40±15.824.50±1.5223.3±12.328.30±6.97青年組 17.17±14.231.17±3.259.50±7.041.47±1.45 t值 2.5590 2.2734 2.3650 2.3500 P值老年組0.0284 0.0463 0.0396 0.040

2.2 Western印跡檢測 HSP70 在海馬與額葉，老年組的HSP70水平也明顯低于青年組(P＜0.05)，見表2，圖1。

表2 Western印跡檢測HSP70表達結果比較(±s，n=6)

表2 Western印跡檢測HSP70表達結果比較(±s，n=6)

組別 海馬組 額葉組老年組0.75±0.080.51±0.08青年組 0.89±0.060.72±0.16 t/P值3.4293/0.0064 2.8755/0.0165

圖1 兩組間HSP70的Western印跡檢測對比

2.3 RT-PCR檢測HSP70 mRNA表達 在海馬與額葉，老年組的HSP70水平也明顯低于青年組(P＜0.05)。見表3，圖2。

2.4 免疫組化檢測HSP70蛋白表達 在海馬與額葉，HSP70染色呈+及以下的，老年組明顯高于青年組，而及以上的，老年組明顯低于青年組(P＜0.05)。見表4，圖3。

表3 HSP70 RT-PCR結果比較(±s，n=6)

表3 HSP70 RT-PCR結果比較(±s，n=6)

組別 海馬組 額葉組老年組0.93±0.020.88±0.08青年組 1.05±0.051.08±0.09 t/P值5.4583/0.0003 4.0684/0.0023

圖2 HSP70 mRNA RT-PCR結果比較

表4 免疫組化檢測HSP70蛋白表達比較(n=6，n)

圖3 免疫組化法檢測HSP70蛋白表達(DAB，×10)

3 討論

抑郁癥通常表現為以情緒低落為核心癥狀，并表現出興趣低下，活動減少，飲食睡眠等改變，可伴有植物神經癥狀，持續2 w以上，反復發作的精神疾病由于本病對工作、生活、人際關系有明顯的影響，甚至會導致絕望、自殺，危害嚴重〔4〕。本研究借助慢性溫和應激來構建鼠的抑郁癥模型〔5〕。通過隨后的糖水偏好實驗、敞箱實驗、強迫游泳實驗對鼠的抑郁癥狀進行觀察、評價、量化、記錄。動物在實驗中表現出來的糖水偏好減少，運動減少，甚至不動，分別與抑郁中的興趣低下，活動減少，絕望等癥狀相對應。一系列研究顯示抑郁癥中也存在氧化應激、神經細胞凋亡、神經可塑性改變等病理生理過程〔2〕。老年期的抑郁癥發病率高達到36.8%〔1〕，這可能與老年期應激應答能力、抗氧化、抗凋亡能力以及神經重塑能力衰退有關〔3〕。而HSP70作為抗氧化、抗凋亡的蛋白，且參與腦源性神經生長因子(BDNF)介導的神經營養作用〔2〕，與抑郁癥和老年期腦改變均有關聯，所以本研究的目的就是要了解慢性溫和應激中HSP70的反應能力，是否會因為老齡而下降。本研究說明老年期大鼠在應激狀態下更容易出現抑郁癥狀，而且HSP70在老年期的腦組織中反應能力也降低。雖然HSP70是應激狀態下多種細胞內都會產生的，對細胞產生保護作用的蛋白質家族成員之一，它可以與伴侶蛋白質51 kD FK506結合蛋白協作，負反饋調節糖皮質激素受體(GR)活性〔6〕;也可以通過抑制一氧化氮合酶(NOS)和活性氧(ROS)的活性，而產生抗氧化〔7〕;還可通過與凋亡信號調節激酶(ASK1)結合，阻礙 JNK1活性，穩定PKC和Akt，而抑制caspase-3凋亡等多條途徑產生抗凋亡的作用〔8〕;而且提高 HSP70的許多物質，如多酚類、原花青素、HDAC抑制劑等，均可提高BDNF水平，有增加神經元的可塑性的作用〔9〕。但是老年期大鼠的研究顯示，老年期大鼠海馬在無應激刺激的狀態下，也存在著應激時才應該出現的皮質酮(CORT)水平增高及星形膠質細胞反應，而且老年期大鼠應激后CORT水平恢復的時間要比正常對照恢復的時間延長〔10〕。老年期大鼠的CORT結合蛋白(CBGs)水降低，糖皮質激素受體興奮性高，更容易激活Bcl-2，導致凋亡〔11〕。另外老年期的BDNF以及其受體的水平都有一定程度的下降，從而會影響神經的重塑能力〔12〕。這些因素不光會導致老年期抑郁癥狀更容易出現，還與HSP70降低有關。老年的這種類似應激的持續狀態，會導致細胞核與細胞質中的 HSP70水平下降〔13〕，這與HSP70在蛋白水平與RNA水平均降低的表現一致。

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