Amiloride通過抑制缺氧誘導的NHE1表達而延緩calpain介導的ABCA1降解*

莫顯剛， 張 莉， 張洛超， 王 龍， 向 凝， 楊 涓， 宋 翔

(貴州醫科大學附屬醫院老年病科，貴州貴陽550004)

動脈粥樣硬化斑塊中缺氧普遍存在，缺氧參與動脈粥樣斑塊形成發展［1-2］。膽固醇逆轉運在泡沫細胞及動脈粥樣斑塊形成中起重要作用，三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)是細胞膽固醇外流重要門戶［3］。研究表明缺氧導致ABCA1轉錄水平及蛋白水平下調［2，4］。但缺氧是否引起ABCA1降解加速而導致蛋白水平下調尚未見研究。ABCA1蛋白被鈣蛋白酶(Ca2+-dependent cysteine proteinase，calpain)特異性結合而降解，抑制calpain依賴ABCA1蛋白降解可能是抗動脈粥樣硬化治療重要靶點［3］。我們既往研究發現缺氧導致內皮細胞鈉氫交換體1(sodium-hydrogen exchanger 1，NHE1)表達及 calpain活性增加［5］，由此推測缺氧導致 NHE1表達及 calpain活性改變，進而加速ABCA1降解。為此，我們以RAW264.7細胞為研究對象，探討缺氧對ABCA1降解的影響。

材料和方法

1 實驗干預及分組

RAW264.7細胞(中科院細胞所)培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12(Hyclone)培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合至80% ～90%時，0.25%胰酶消化離心細胞，常規傳代。實驗分為3部分:(1)缺氧處理:使用1%O2、5%CO2及94%N2飽和濕度下培養，按缺氧時間將RAW264.7細胞分為缺氧0 h(對照組)、12 h、24 h及48 h共4組，繼而檢測細胞活力、NHE1表達、細胞內鈣離子濃度(［Ca2+］i)及calpain活性;(2)檢測ABCA1降解:將缺氧24 h的細胞按文獻［6］使用放線菌酮(cycloheximide;終濃度100 mg/L;Sigma)抑制細胞蛋白表達，并給予或不給予NHE1抑制劑阿米洛利(amiloride;終濃度100 μmol/L;Sigma)干預，分為對照組、缺氧組及缺氧+amiloride組，免疫印跡檢測3組在0 h、6 h及12 h ABCA1蛋白的相對含量;(3)為探討NHE1參與ABCA1降解的機制是否與calpain相關，以常氧培養細胞為對照，給予calpain抑制劑ALLN(終濃度100 μmol/L;Sigma)及胞內鈣離子螯合劑BAPTA-AM(終濃度100 μmol/L;Sigma)缺氧細胞干預12 h，共分為對照組、amiloride組、缺氧組、缺氧+amiloride組、缺氧 +ALLN組、缺氧+ALLN+amiloride組、缺氧+BAPTA組和缺氧+BAPTA+amiloride組共8個組，免疫印跡法檢測ABCA1蛋白的相對含量及calpain活性。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測細胞存活率 取對數生長期的RAW264.7細胞，以每孔5×103密度接種于96孔板，待細胞貼壁之后，給予缺氧不同時間，隨后每孔加入20 μL MTT(Sigma)，在二氧化碳培養箱37℃孵育4 h后，棄去上清，每孔加人150 μL DMSO，振蕩后使用酶標儀于492 nm處檢測吸光度(A)值，正常缺氧0 h組作為對照組，僅加入150 μL DMSO的孔作為空白對照。細胞存活率=(實驗組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)。

2.2 實時熒光定量 PCR 缺氧不同時間的RAW264.7細胞，提取總RNA，提取過程嚴格按照總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒說明操作。Realtime PCR 25 μL反應體系包括 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 12.5 μL、cDNA 模板 1 μL、NHE-1或β-actin上下游引物各0.5 μL。PCR進行35個循環，所有樣本的CT值均由熒光定量PCR擴增儀GeneAmp 7300(Applied Biosystems)讀取，得到樣本中NHE-1和β-actin的Ct值。結果分析以βactin作為內參照，NHE1相對表達量采用2－ΔΔCt法進行計算。

2.3 Western blot檢測NHE1及ABCA1蛋白的表達按試劑盒提取不同處理RAW264.7細胞蛋白。將細胞消化離心收集細胞，同時收集細胞培養液中的細胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細胞10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，振蕩混勻，BCA法測蛋白濃度，將蛋白分裝－80℃保存。20～60 μg蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉移到PVDF膜上，5% 脫脂牛奶封閉2 h，孵育 I抗(NHE1，1∶500，Abcam;ABCA1，1∶1 000，Abcam)，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min，孵育II抗，37℃孵育1 h，TBST洗3次，顯影、定影。使用ImageJ分析軟件進行分析。

2.4 細胞內Ca2+濃度的測定［7］取對數生長期細胞按每孔2.5×105接種6孔板，取缺氧不同時間的RAW264.7細胞，PBS沖洗2遍，加入終濃度5 μmol/L Fluo-3/AM(碧云天生物工程)的PBS避光37℃下干預60 min，每10 min振蕩細胞1次，用PBS沖洗細胞3次之后避光靜置20 min以保證細胞內的Fluo-3/AM完全變成Fluo-3，僅加入PBS的細胞作為空白對照之后，使用倒置熒光顯微鏡拍照。細胞干預后使用胰蛋白酶消化加入Fluo-3/AM進行流式細胞儀檢測。

2.5 Calpain活性的測定 按calpain活性檢測試劑盒(Promega)操作步驟進行檢測。經不同處理因素干預RAW264.7細胞中加入無鈣裂解液，取50 μL蛋白上清液用來檢測calpain活性。每個樣品分別加入含鈣或無鈣的緩沖液，再加入特異性熒光底物Suc-LLVY-aminoluciferin，37℃反應4 h，在酶標儀上讀數(激發和發射波長分別為355和460 nm)，其活性用含鈣樣品的讀數減無鈣樣品的讀數計算。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，單因素方差分析后，組間差異比較用SNK-q檢驗或Tamhane T2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同缺氧時間對RAW264.7缺氧細胞活力及細胞死亡比率的影響

相對于對照組，其余各組細胞存活率均降低，缺氧24 h較缺氧12 h組差異不顯著，48 h較0 h、12 h及24 h組均明顯降低(P＜0.05)。臺盼藍拒染實驗示檢測缺氧增加死亡細胞比率(P＜0.05)，48 h較0 h、12 h及24 h 3組明顯增加(P＜0.05)，24 h與12 h比較差異不顯著，見圖1。

Figure 1.The effects of hypoxia on cell viability and cell survival.A:the results of MTT assay;B:the results of Trypan blue staining assay.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖1 缺氧對細胞活力及細胞死亡的影響

2 不同時間缺氧NHE1表達結果

RAW264.7細胞缺氧后NHE1表達較非缺氧組上調，缺氧12 h mRNA升高較明顯，隨缺氧時間延長，mRNA升高幅度減小(P＜0.05)。缺氧后的蛋白水平，12 h升高，隨缺氧時間延長NHE1蛋白表達升高，但48 h與24 h比較差異不顯著。結合細胞活力結果，以下實驗選擇缺氧24 h的細胞檢測ABCA1降解，見圖2。

Figure 2.The effect of hypoxia on the expression of NHE1 at mRNA and protein levels.A:the results of real-time PCR;B:the results of Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖2 缺氧對NHE1 mRNA及蛋白表達的影響

3 缺氧對［Ca2+］i及calpain活性影響結果

在缺氧不同時間給予鈣離子敏感熒光染料，結果顯示隨缺氧時間延長，鈣離子濃度升高;流式細胞術檢測亦顯示缺氧時間延長，鈣離子濃度升高。隨缺氧時間延長，calpain活性升高，見圖3。

Figure 3.［Ca2+］iand calpain activity affected by hypoxia.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 12 h;△P＜0.05 vs 24 h.圖3 缺氧對細胞內鈣離子濃度及calpain活性的影響

4 Amiloride對缺氧24 h細胞ABCA1降解的影響

缺氧24 h細胞給予cycloheximide抑制蛋白合成6 h及12 h，同時給予或不給予amiloride干預，提取蛋白行Western blot檢測ABCA1的蛋白水平。結果顯示amiloride干預組的ABCA1量隨時間進行性降低，下降幅度較未干預組及對照組緩慢，見圖4。

5 ALLN及BAPTA對ABCA1降解的影響

為探討amiloride延緩ABCA1降解機制是否與calpain相關，給予或不給予 ALLN及 BAPTA，檢測ABCA1蛋白量。結果顯示給予calpain抑制劑ALLN組ABCA1蛋白量高于無ALLN組(單純缺氧組)，而給予細胞內鈣離子螯合劑BAPTA干預，結果類似于ALLN干預作用;在amiloride聯合ALLN或 BAPTA干預可進一步升高ABCA1蛋白量，但與單純amiloride干預的蛋白量相比較，差異無統計學意義。不論是單純給予amiloride或ALLN或BAPTA干預缺氧24 h的細胞，還是amiloride聯合ALLN或BAPTA處理，calpain的活性較缺氧組顯著降低。結果還發現常氧條件下amiloride組與對照組比較，蛋白水平及calpain活性差異均無統計學意義，見圖5。

討 論

缺氧導致細胞ABCA1蛋白量降低及膽固醇外流異常［2，4］。本研究旨在探討缺氧處理的 RAW264.7細胞在轉錄及翻譯水平降低之外，是否存在ABCA1蛋白降解增加。本研究發現缺氧可增加NHE1表達、細胞內鈣離子濃度及calpain活性;NHE1抑制劑延緩缺氧細胞 ABCA1蛋白降解，提示缺氧誘導NHE1可能通過增加細胞內鈣離子濃度及calpain活性改變參與ABCA1蛋白降解。

Figure 4.The effect of amiloride on ABCA1 protein levels.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia;△P＜0.05 vs 0h;▲P＜0.05 vs 6 h.圖4 Amiloride對ABCA1蛋白量的影響

Figure 5.The effects of ALLN and BAPTA on ABCA1 degradation and calpain activity.Con:control;Am:amiloride;H:hypoxia;AL:ALLN;BA:BAPTA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Am;#P＜0.05 vs H;△P＜0.05 vs H+AL;▲P＜0.05 vs H+BA.圖5 ALLN及BAPTA對ABCA1蛋白降解及calpain活性的影響

細胞缺氧導致核因子HIF-1α積聚，后者啟動下游靶基因激活轉錄。NHE1啟動子中存在HIF-1α的缺氧反應元件，缺氧可以誘導NHE1表達升高。本研究也發現缺氧誘導RAW264.7細胞NHE1表達升高，這與我們以前的研究及其它研究一致［5，8-9］，表明在心肌微血管內皮細胞、人臍靜脈血管內皮細胞、肺動脈平滑肌細胞及巨噬細胞細胞系中均發現缺氧誘導上述細胞NHE1表達增加。本研究發現隨缺氧時間增加，NHE1的mRNA表達有升高后再降低趨勢，可能是隨缺氧時間增加，缺氧細胞整體功能呈降低趨勢。研究亦表明NHE1蛋白隨缺氧時間逐漸升高，可能原因系NHE1蛋白降解半衰期長［10］，提示缺氧誘導NHE1可能在細胞復氧時仍將細胞內產生過多的氫離子排除細胞外，對細胞生存極為重要。

NHE1在結構上包括細胞內起調節功能結構域及構成離子通道跨膜域，被認為是細胞膜上重要的支架蛋白。細胞內結構域與細胞內眾多細胞信號通路相聯系，調節或參與眾多細胞功能如細胞增殖、分化、遷徙、凋亡、血管生成、代謝調節等［11］。本研究還發現缺氧后鈣離子濃度增加及激活calpain活性。這與在內皮細胞及RAW264.7細胞中研究類似，其可能機制是NHE1激活，通過氫鈉交換，細胞內鈉離子濃度增加，激活鈉鈣交換，導致細胞內鈣離子濃度增加［12-13］。Calpain是鈣離子依賴的蛋白酶，細胞內鈣離子濃度升高激活calpain。NHE1/calpain激活參與細胞生理及病理生理功能活動如細胞凋亡、運動等。

既往研究表明缺氧可降低ABCA1轉錄水平及蛋白水平表達［2，4］，而本研究重點是探討缺氧能否參與ABCA1降解。本研究預實驗提示缺氧+NHE1抑制劑干預對細胞活力影響極大(結果未提供)，鑒于NHE1蛋白降解半衰期長，采用缺氧后復氧細胞進行研究。研究中cycloheximide抑制蛋白合成翻譯過程，排除新蛋白產生對研究的影響，對ABCA1蛋白降解研究方法比較可靠。常氧條件下amiloride干預未能顯著改變蛋白水平及calpain活性，提示ABCA1蛋白水平及calpain活性改變可能與缺氧誘導NHE1密切相關。本研究的重要發現是相對于對照組，NHE1抑制劑可以延緩缺氧后RAW264.7細胞中ABCA1降解;calpain抑制劑ALLN及細胞內鈣離子螯合劑 BAPTA亦可升高 ABCA1蛋白水平，但是amiloride基礎上ALLN或BAPTA干預，ABCA1蛋白水平并未高于單純給予amiloride組蛋白水平;給予amiloride、ALLN或BAPTA都顯著降低calpain活性。ABCA1降解存在calpain依賴或非依賴2種降解方式［6］。本研究結果還提示缺氧誘導NHE1及calpain活性增加，至少部分參與ABCA1降解加速過程，導致缺氧后ABCA1蛋白水平下降。除此之外，缺氧誘導ABCA1降解可能存在calpain非依賴降解方式，具體機制有待進一步明確。

除缺氧外，血管緊張素系統［14］、高糖［15］及脂多糖等致動脈粥樣硬化的因子也可激活或誘導NHE1，或許能增加calpain活性及促進ABCA1降解，對于進一步探討動脈粥樣硬化形成機制提供新的思路。另外ABCA1與HDL關系極其密切，呼吸暫停低氧血癥綜合征患者發生冠心病幾率增加，并有血脂代謝紊亂，其中重要改變是HDL水平降低［16-17］。本研究發現缺氧導致ABCA1降解加速，在一定程度上可部分解釋上述HDL水平降低的發病機制。

本研究仍存在一些不足。缺氧時間僅選擇12 h、24 h及48 h，尚未完全闡明缺氧對NHE1時空表達，如短暫缺氧對非轉錄水平的影響。本研究尚需對NHE1活性做進一步研究。NHE1抑制劑藥物濃度選擇需更為細化。

總之，本研究缺氧誘導NHE1表達，上調細胞內鈣離子濃度及calpain活性，進而加速ABCA1降解。表明缺氧誘導NHE1表達可能是ABCA1降解的重要機制。本研究為進一步探討缺氧導致細胞脂質代謝異常以及NHE1參與動脈粥樣硬化斑塊形成機制有重要意義。

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