人羊膜上皮細胞移植改善AD樣病變模型大鼠學習記憶能力

人羊膜上皮細胞移植改善AD樣病變模型大鼠學習記憶能力*

董世桃1，方寧1，胡龍淼1，陳代雄1△，趙春華2

(1遵義醫學院附屬醫院細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003；2中國醫學科學院基礎醫學研究所組織工程研究中心，北京 100005)

[摘要]目的： 觀察人羊膜上皮細胞(hAECs)對阿爾茨海默病(AD)樣病變大鼠模型的治療效應。方法: 采用胰蛋白酶消化法分離hAECs，流式細胞術分析表型。48只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、培養基組和hAECs移植組，每組12只。采用雙側腦室注入脂多糖(LPS)復制AD樣病變大鼠模型。AD樣病變大鼠海馬區移植5×105個hAECs。細胞移植后2周，Morris水迷宮試驗觀察行為學變化，HE和硫磺素S染色觀察海馬病理變化，免疫組化染色檢測β-淀粉樣蛋白42(Aβ42)、Tau蛋白和乙酰膽堿(ACh)的變化， 流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群的變化，流式微球陣列捕獲技術(cytometric bead array，CBA)檢測血清細胞因子含量，免疫熒光染色檢測海馬區人細胞核抗原陽性細胞及其神經元特異性核蛋白(NeuN)的表達。結果: 與模型組和培養基組比較，hAECs移植組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，跨域平臺次數明顯增加(P<0.05)；海馬神經元病損減輕，Aβ沉積減輕(P<0.05)，磷酸化Tau蛋白水平下降(P<0.05),ACh增加(P<0.05)；外周血Th1和Th17細胞百分比下降(P<0.05)，而Th2和Treg細胞升高(P<0.05)；IL-2和IFN-γ水平下調(P<0.05)，而IL-4上調(P<0.05)；移植區可見hAECs，并表達NeuN。結論: hAECs可明顯改善AD樣病變模型大鼠空間辨別性學習記憶能力，減輕海馬病理損傷，其免疫調節效應可能發揮重要作用。

[關鍵詞]阿爾茨海默病； 人羊膜上皮細胞； β-淀粉樣蛋白； 學習記憶障礙

[中圖分類號]R392.1[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.019

[文章編號]1000-4718(2015)11-2047-06

[收稿日期]2015-08-20[修回日期] 2015-10-12

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 30901542)；廣東省自然科學基金自由申請項目(No. 2014A030313055)；產學研合作項目(No. 2014B090901043)；廣東省科技計劃(No. 2012B031800056)；中山大學高校基本業務費青年教師培育資助項目(No. 12ykpy44)

通訊作者△Tel: 020-85252170； E-mail: doctorwanghui@126.com

Transplantation of human amnion epithelial cells improves learning and memory function in Alzheimer’s disease-like pathology rat modelDONG Shi-tao1, FANG Ning1, HU Long-miao1, CHEN Dai-xiong1, ZHAO Chun-hua2

(1KeyLaboratoryofCellEngineeringofGuizhouProvince,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China;2CenterofTissueEngineering,InstituteofBasicMedicalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100005,China.E-mail:cellgene@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To observe the treatment effect and its immune regulation of human amnion epithelial cells (hAECs) on Alzheimer’s disease (AD)-like pathology rat model. METHODS: The hAECs were isolated from amnion with trypsin digestion, and the phenotype of hAECs was analyzed by flow cytometry. SD rats (n=48) were randomly divided into sham control group, model group, medium group and hAECs group. AD-like pathology rat model was induced by bilateral intraventricular injection of lipopolysaccharide (LPS). hAECs (5×105) were injected into the hippocampus of the AD-like pathology rats. At 2 weeks after transplantation, the animals were tested by Morris water maze to observe the function of learning and memory. The pathological change of the brain was observed by HE staining. The expression of amyloid β-protein 42 (Aβ42) and Tau protein and the level of acetylcholine (ACh) in the injury brain were determined by immunohistochemistry. The survival and differentiation of hAECs in the hippocampus were measured by immunofluorescent technique. The percentages of lymphocyte subsets in the peripheral blood mononuclear cells were analyzed by flow cytometry. The contents of serum cytokines were detected by cytometric bead array. RESULTS: Compared with model group and medium group, hAECs group showed shortened escape latency (P<0.01), increased frequency of going through the platform (P<0.05), reduced loss of hippocampal neurons, decreased expression of Tau protein and Aβ42 in the hippocampus (P<0.05), increased ACh level in the hippocampus (P<0.05), decreased percentages of Th1 and Th17 subsets, increased percentages of Th2 and Treg cells (P<0.05), decreased concentrations of IFN-γ and IL-2 in the serum, and increased concentration of IL-4 (P<0.05). CONCLUSION: hAECs improve the cognitive learning and memory function and alleviate pathologic damage of hippocampus through immune regulation in AD-like pathology rats.

[KEY WORDS]Alzheimer’s disease; Human amniotic epithelial cells; Amyloid β-protein; Learning and memory impairment

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的退行性神經系統疾病，其發病機制尚不完全清楚，治療方法十分有限。隨著干細胞技術的發展和對干細胞生物學特性的深入了解，干細胞移植可望成為治療AD的有效手段。近年來，人們對人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)的生物學特性進行了深入的研究，證明從足月分娩胎盤羊膜分離的hAECs仍保留了胚胎干細胞的某些特性，不表達HLA-A、B、C、DR抗原和共刺激分子(B7-1和B7-2)[1-2]，能合成、釋放多巴胺、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和多種神經營養因子[3-4]。hAECs的這些生物學特性為治療神經系統退行性疾病提供了可能。目前尚未見有關hAECs治療AD的報道。本實驗旨在觀察hAECs移植對AD樣病變大鼠模型的治療效應及其可能機制，為臨床治療AD提供實驗依據。

材料和方法

1動物

清潔級成年雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，購自第三軍醫大學動物中心，許可證號為SCXK (渝) 2012-0006。實驗中動物處置符合科技報《關于善待實驗動物的指導意見》的規定。

2主要試劑

LG-DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco；用于流式細胞術(flow cytometry，FCM)的熒光標記抗體和細胞因子流式細胞微球陣列(cytometric bead array，CBA)檢測試劑盒購自BD；鼠抗人波形蛋白抗體、脂多糖和硫磺素S購自Sigma；鼠抗人CK19 抗體購自GeneTech；鼠抗人細胞核抗原抗體、小鼠抗大鼠乙酰膽堿(ACh)抗體和熒光標記的小鼠抗大鼠神經元特異性核蛋白(NeuN)抗體購自Millipore；兔抗大鼠β-淀粉樣蛋白42(amyloid β-protein 42，Aβ42)抗體和磷酸化Tau抗體購自Abcam。

3主要方法

3.1hAECs分離、培養及表型分析經產婦知情同意采集足月剖宮產胎盤，按本室建立的方法從羊膜提取hAECs[5]。將分離的hAECs懸浮于含10% 胎牛血清、1% GlutaMAX、1%β-巰基乙醇、1%非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)和10 μg/L表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的L-DMEM培養基中，按5×105/cm2接種于培養瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。細胞生長面積達80%以上即進行傳代培養，至第3代用于細胞治療，并采用流式細胞儀(BD)檢測其表型。熒光標記抗體為CD29-PE、CD44-FITC、CD73-PE、E-Cad-PE、CD326-FITC、CD49f-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD80-FITC、CD86-PE和HLA-DR-FITC，同型對照為相應熒光素標記的小鼠IgG，每份樣品采集細胞數 ≥20 000個，采用Cell Quest軟件分析。為了排除羊膜間充質干細胞的污染，制備hAECs爬片，采用免疫組化染色檢測上皮標志CK19。

3.2AD模型制備與分組參照文獻[6]造模。動物麻醉后固定于腦立體定位儀上，保持前后囟水平。術區常規消毒，暴露前囟，根據大鼠腦立體定位圖譜[7]，側腦室注射點的座標定位為前囟后1 mm，距離矢狀縫1.5 mm，顱骨下3.5 mm。雙側腦室注入脂多糖溶液(終濃度為10 g/L)，每側5 μL。術后1周進行Morris水迷宮測試，與正常組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數比較，差異具有統計學顯著性判為AD造模成功。隨機數字表法將AD大鼠隨機分為模型(model)組、培養基(medium)組和hAECs移植組(hAECs)，設假手術(sham)組作為平行對照，每組12只。Sham組以10 μL生理鹽水代替脂多糖, 其余操作同模型組。

3.3hAECs移植取第3代hAECs，用L-DMEM培養基制成細胞懸液。造模后2周，hAECs移植組大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，根據大鼠腦立體定位圖譜確定海馬區注射位點，座標定位為前囟后3 mm、距離矢狀縫2.2 mm、顱骨下3.5 mm，每只注射10 μL hAECs懸液(含5×105個細胞)。Medium組以相同的部位注射等體積L-DMEM培養基。Model和sham組不作處理。

3.4行為學檢查hAECs移植前、后進行Morris水迷宮定位航行和空間探索實驗[8]，以評價大鼠學習記憶能力。定位航行實驗每天上、下午各1次，持續5 d。將大鼠面向池壁分別從4個象限放入水中，攝像記錄其找到平臺所需時間即逃避潛伏期。如果 120 s內未能找到平臺，則引導至平臺上，停留30 s，其逃避潛伏期記錄為120 s。取4個象限平均值為該次實驗的成績。定位航行實驗結束后進行空間探索實驗，撤除平臺后任選一個入水點將鼠放入水中，攝像記錄其在2 min內跨越原平臺所在位置的次數。

3.5病理學檢查hAECs移植后2周，各組大鼠在麻醉下，經腹主動脈抽取外周血，主動脈弓灌注4%多聚甲醛，取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行以下檢測：(1)常規HE染色觀察海馬神經元形態變化；(2)硫磺素S染色觀察海馬區Aβ沉積；(3)免疫組化染色檢測Aβ42、Tau蛋白及ACh：石蠟切片常規脫蠟致水，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，3% H2O210～15 min，山羊血清封閉液20 min，滴加 I 抗(兔抗大鼠Aβ42抗體、兔磷酸化Tau蛋白抗體和小鼠抗大鼠ACh抗體，均1∶100稀釋), 4 ℃過夜，滴加免疫組化試劑盒A液室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡觀察。每張切片海馬區隨機取3個視野, 用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性產物積分吸光度(IA)，以12張切片的平均IA值表示檢測物的相對表達量。

3.6免疫熒光染色腦冰凍切片山羊血清封閉，滴加 I 抗MAB1281 (1∶100)，4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗羊抗小鼠IgG-FITC，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，滴加NeuN-PE抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，DAPI復染，熒光顯微鏡觀察。

3.7流式細胞術檢測T細胞亞群外周血加入等體積PBS稀釋，用淋巴細胞分離液提取單個核細胞。加人0.02 mg/L的佛波酯、1 mg/L的離子霉素和10 mg/L的布雷菲德菌素A，37 ℃培養箱孵育4 h。收集細胞，調整細胞濃度至l×109/L。取細胞懸液200 μL，加入5 μL Ab CD4-APC，室溫避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定20 min，加破膜緩沖液作用10 min。按組合方案加入相應的小鼠抗大鼠Ab IFN-γ-FITC、IL-4-PE、IL-17-FITC和FoxP3-PE，用相應熒光素標記的小鼠IgG作為同型對照。室溫避光孵育30 min，PBS充分洗滌，1%多聚甲醛固定，4 ℃避光放置。所有樣本24 h內上機檢測，每份樣品采集的細胞數 ≥20 000個，采用Cell Quest軟件分析CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)、CD4+Foxp3+(Treg)和CD4+IL-17+(Th17)亞群百分率。

3.8流式微球陣列檢測細胞因子先用BD Calibrite Beads試劑通過BD FACSComp軟件設置FCM的基本參數(設門、電壓、補償)，隨后用試劑盒中的細胞因子標準品按梯度法稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256，加上最高濃度和陰性對照制定細胞因子標準曲線。待測樣品1 500 r/min離心5 min，吸取50 μL上清液于待測管中，加入50 μL 5種捕獲微球混合物，孵育1 h，加入50 μL PE檢測試劑，室溫避光孵育2 h。加入1 μL洗液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μL洗液上機檢測。采用 BD CBA分析軟件，自動繪制出標準曲線，測出待測樣品中細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α的含量。

4統計學處理

實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，以均數±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1hAECs形態及表型特征

原代hAECs形態呈三角形、圓形，第3代hAECs貼壁生長，多為卵圓形，呈鋪路石樣生長，表達上皮標志CK19，見圖1。第3代hAECs不表達CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR，表達CD29、CD44、CD73、CD49f、E-Cad和CD326，見圖2。

Figure 1.The morphology of cultured hAECs and positive expression of CK19 (×100). A: primary hAECs； B: positive expression of CK19.

圖1hAECs形態及CK19免疫組化染色

Figure 2.The phenotypic analysis of hAECs by flow cytometry analysis.

圖2hAECs流式細胞術表型分析

2行為學檢查結果

與模型組和培養基組比較，hAECs移植后2周，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，跨越平臺次數明顯增加(P<0.05)；而與假手術組比較差異無統計學意義，見圖3、4。

3腦組織病理變化

模型組和培養基組大鼠海馬齒狀回顆粒層神經元層數和數量減少，細胞間隙變大，排列紊亂，部分細胞體積縮小，細胞核固縮，并有變性、壞死；海馬區大量Aβ沉積，Aβ42和磷酸化Tau蛋白均明顯上調，其平均IA值顯著高于假手術組(P<0.01)，而ACh呈弱陽性，其平均IA值明顯低于假手術組(P<0.05)。hAECs移植后2周，AD樣病變大鼠海馬神經元的損傷明顯減輕, 細胞形態和排列大致正常；Aβ沉積明顯減少， Aβ42和磷酸化Tau蛋白均明顯下調，其平均IA值均明顯低于模型組和培養基組(P<0.05)；而ACh水平增加，其IA值高于模型組和培養基組，見圖5、表1。

4hAECs在海馬區分布及分化

hAECs移植后第2周，海馬區可見人細胞核特異性抗原陽性細胞，其中多數細胞表達NeuN(MAB1281+/NeuN+細胞)，見圖6。

Figure 3.The changes of escaping latency from AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation. Mean±SD.n=12.#P<0.05,##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group and medium group.

圖3hAECs移植后2周AD樣病變大鼠逃避潛伏期的變化

Figure 4.The changes of the frequency of going though platform from the AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation. Mean±SD.n=12.#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group and medium group.

圖4hAECs移植后2周AD樣病變大鼠跨越平臺次數的變化

5外周血T淋巴細胞亞群變化

與假手術組比較，模型組和培養基組外周血Th1和Th17細胞亞群明顯升高(P<0.05)，Th2和Treg細胞無明顯改變；與模型組和培養基組比較，hAECs細胞治療后2周AD大鼠Th1和Th17細胞明顯降低(P<0.05)，Th2和Treg細胞明顯升高(P<0.05)，見表2。

Figure 5.The pathological changes of brain tissues from the AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation (×200).

圖5hAECs 移植后2周AD樣病變大鼠腦組織病理變化

表1各實驗組大鼠海馬區Aβ42、Tau 及ACh的變化

Table 1.The changes of Aβ42, ACh and Tau in the hippocampus in different groups (Mean±SD.n=12)

GroupAβ42TauAChSham40.36±15.9241.91±34.91268.22±57.38Model178.52±25.44##154.59±36.24##80.24±25.92##Medium161.86±62.88##141.74±33.88##78.02±40.46##hAECs26.88±14.10**50.92±25.11**236.41±76.70**

##P< 0.01vssham group；**P<0.01vsmodel group and medium group.

6血清細胞因子的變化

模型組和培養基組血清Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2含量較之假手術組明顯升高(P<0.05)；與模型和培養基組比較，hAECs移植后2周大鼠IFN-γ和IL-2水平明顯下降(P<0.05)，而Th2型細胞因子IL-4明顯升高(P<0.05)，TNF-α和IL-10則無明顯變化，見表3。

討論

細胞類型的鑒定是細胞治療過程中重要的質控環節。目前尚無公認的hAECs表型鑒定譜系標志。

Figure 6.The expression of NeuN in the hAECs in hippocampus (immunofluorescence staining, ×200). A: bright field; B: human nuclear antigen positive; C: NeuN positive; D: DAPI staining; E: Merged.

圖6海馬區植活的hAECs表達NeuN

表2　各實驗組外周血T淋巴細胞亞群百分率

#P<0.05vssham group;△P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsmedium group.

本實驗結果顯示，用于移植的第3代hAECs不表達CD34、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和HLA-DR, 高表達CD29、CD44、CD73、CD49f、CD326(Ep-CAM)、E-Cad和CK19，說明用于移植的第3代hAECs仍保持了良好的上皮細胞表型特征。值得指出的是hAECs不表達HLA-DR以及共刺激分子B7-

表3　各實驗組血清細胞因子含量的比較

#P<0.05vssham group;△P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsmedium group.

1 和B7-2，說明hAECs具有不被異種或同種異基因免疫細胞識別的免疫豁免特性。

目前常用的AD樣病變造模方式有物理損傷、化學損傷及轉基因老年動物等方法，但都很難精確反映人類AD發病機制和病理過程，迄今為止尚無一個公認的最佳AD樣病變造模方法。本實驗采用LPS直接注入雙側腦室建立大鼠AD樣病變模型，主要病理變化表現為大腦海馬區神經元明顯減少，大量Aβ沉積，磷酸化Tau蛋白呈陽性反應，伴有空間識別性學習、記憶障礙，表明用LPS建立的AD樣病變模型能較好地模擬AD的病理特征和臨床表現。水迷宮實驗結果顯示，AD樣病變大鼠hAECs海馬區移植后2周，逃避潛伏期縮短，測試第3天至第5天達與假手術組明顯差別，跨域平臺象限的次數也接近假手術組，說明AD樣病變大鼠空間識別性學習和記憶能力得以明顯改善。病理檢查發現，hAECs治療組大鼠海馬齒狀回顆粒層神經元增多，Aβ沉積減少，Tau蛋白異常磷酸化減輕，ACh水平明顯升高。這些證據表明，hAECs移植均可明顯改善AD樣病變大鼠認知功能和減輕腦組織特征性的病理改變。

Aβ在細胞外異常沉積和異常磷酸化Tau蛋白形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)是AD最主要的病理學特征。 普遍認為，Aβ聚集是AD的起始因子，Aβ沉積可對興奮性突觸和抑制性中間神經元的ACh釋放產生神經毒性作用，導致廣泛的突觸功能異常，同時選擇性攻擊GABA能抑制性神經元，使皮質和海馬內興奮性神經元抑制減弱而過度興奮，從而引起神經環路或網絡功能異常，導致認知能力障礙[9-11]。Aβ以多種形式存在于生物體內，其中Aβ40和Aβ42是最主要的亞型，后者較前者多2個疏水氨基酸，更容易在腦內聚集，具有更強的毒性和成纖維性[12-13]。Tau蛋白主要分布于神經元軸突，與微管結合有助于軸突的正常生理功能。大量Aβ可引發Tau蛋白過度磷酸化，過度磷酸化的Tau蛋白聚集在神經元樹突棘，一方面可進一步增強Aβ誘導的興奮性神經毒性作用[14]；另一方面，可導致腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的軸突運輸異常，使突觸容易疲勞而影響神經遞質的釋放[15]。本實驗發現，hAECs移植后，AD樣病變大鼠腦組織中Aβ42表達和磷酸化Tau蛋白水平均明顯下降。提示由hAECs介導的Aβ42和Tau蛋白下調可能在改善AD樣病變模型大鼠認知功能方面起重要作用。

炎癥和免疫反應是AD發病機制中的重要環節，免疫活性細胞和免疫因子在AD炎癥反應中發揮重要作用[16]。Aβ C端的T細胞表位(Aβ17-21和Aβ29-42 C端)是引起細胞毒作用的核心肽段，可誘導Th1細胞，促進炎癥反應。迄今尚未見有關AD模型動物免疫病理變化的報道。本實驗LPS誘導的AD模型具有明顯的免疫病理特征，表現為Th1和Th17細胞反應過亢，促炎性Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ水平升高。實驗發現，hAECs移植后AD大鼠外周血Th1和Th17細胞百分率明顯下降，Th2和FoxP3+Treg細胞明顯升高，Th1類細胞因子IL-2和IFN-γ水平下調，Th2類細胞因子IL-4上調。Th17是一類重要的介導炎癥反應的細胞，通過分泌IL-17參與各種炎癥反應過程。FoxP3+Treg不僅可抑制自身反應性T細胞增殖，而且在調節機體外源性抗原免疫反應過程中發揮重要作用。本實驗結果提示，hAECs可通過抑制Th1和Th17，上調Th2和FoxP3+Treg，從而抑制AD的炎癥/免疫反應。據此推測，由hAECs介導的免疫調節作用可能在減輕AD神經組織免疫損傷中發揮重要作用。

hAECs治療AD的機制還不完全清楚。相對于其它成體干細胞如MSCs，hAECs具有某些獨特的生物學特性，針對神經性疾病治療最值得關注的價值成分是其神經生物學特性和抗炎作用。hAECs能合成、釋放腦源神經營養因子、神經營養因子3、神經生長因子及其它一些未知的神經生長因子，發揮激活神經細胞再生作用[17]。hAECs還能合成、分泌兒茶酚胺和ACh[3-4]，有助于改善AD、帕金森病、亨廷頓病等神經退行性疾病所引起的認知功能下降。在抗炎方面，hAECs可通過FasL、TRAIL、MIF等免疫抑制因子抑制免疫細胞的趨化活性，抑制T細胞增殖，誘導巨噬細胞由M1型(致炎型)向M2型(抗炎型)轉化，從而發揮抗炎作用[18-19]。我們早先研究證明，hAECs可通過上調FoxP3+Treg和下調Th17改善自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經組織的免疫損傷[20]。這些研究結果提示， hAECs對AD樣病變模型大鼠療效的生物學原理可能涉及其旁分泌機制介導的神經營養、抗炎和免疫調節作用。

hAECs由胚胎上胚層(epiblast)衍化而來，其功能與胚胎發育尤其是神經分化、母-胎免疫耐受及胎兒發育穩態環境有關，而且仍保留了胚胎干細胞的某些特性，向神經元分化無跨胚層障礙。實驗結果顯示，移植到AD樣病變大鼠海馬中的hAECs表達NeuN，這是移植后微環境誘導分化的結果，還是其本身就表達NeuN，還不清楚。因此，尚不能確定移植的hAECs已分化為神經元樣細胞，有待進一步驗證。另一方面，即使hAECs移植后能分化為神經元，它能否與宿主建存神經元整合，并重建新的神經環路，值得深入研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)