高糖激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路致H9c2細胞肥大

高糖激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路致H9c2細胞肥大

徐小紅1△，阮駱陽1，田小華1，潘鳳娟1，楊彩蘭2,柳國勝2

(1廣東省農墾中心醫院兒科，廣東 湛江 524002;2暨南大學第一臨床醫學院兒科，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 利用細胞實驗探討不同高糖濃度培養H9c2細胞是否引起心肌細胞肥大，探討Ca2+-CaN-NFAT3信號通路是否參與高糖引起H9c2心肌細胞肥厚過程。方法: 體外培養H9c2大鼠心肌細胞48 h，分為5 mmol/L糖對照組、25mmol/L糖培養組、50 mmol/L糖培養組、25mmol/L糖培養加L型鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平[商品名絡活喜(Norvasc)]組和50 mmol/L糖培養加Norvasc組5組。觀察H9c2細胞形態并測量細胞表面積大小；熒光分光光度法檢測心肌細胞內鈣離子濃度 [Ca2+]i；ELISA測細胞內CaN濃度；real-time PCR法及Western blot檢測 CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達。結果: 細胞大小、單細胞平均[Ca2+]i測定熒光值及細胞內CaN濃度在隨糖濃度升高呈階梯上升，50 mmol/L時達到最高點。加入Norvasc后細胞大小較相同條件不加Norvasc者降低。CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達隨糖濃度升高逐步升高，50 mmol/L時達最高。加入Norvasc后CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達均較未加Narvasc組明顯降低。結論: 高糖通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路引起H9c2心肌細胞肥大。

[關鍵詞]妊娠期糖尿病； 心肌細胞肥大； 氨氯地平； 鈣調神經磷酸酶; 活化T細胞核因子3

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.015

[文章編號]1000-4718(2015)11-2021-06

[收稿日期]2015-04-30[修回日期] 2015-09-07

[基金項目]*國家自然青年科學基金資助項目(No.81300705;No.81300676; No.81370909)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(No.12ykpy41);廣東省實驗體系建設項目基金(No.2012A061400004)

通訊作者△Tel: 020-85252107； E-mail: xufen3@mail.sysu.edu.cn

High glucose induces H9c2 cardiomyocyte hypertrophy through Ca2+-CaN-NFAT3 signaling pathwayXU Xiao-hong1, RUAN Luo-yang1, TIAN Xiao-hua1, PAN Feng-juan1, YANG Cai-lan1， LIU Guo-sheng2

(1DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofGuangdongAgriculturalReclamation,Zhanjiang524002,China;2DepartmentofPediatrics,theFirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail: 276798575@qq.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the morphological changes of cardiac H9c2 cells during the developmental process of fetal rat. METHODS: Embryonic rat heart-derived H9c2 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. The H9c2 cells were plated at a density of 6 000 cells/cm and divided into 5 groups: H9c2 cells were treated with 5 mmol/L glucose, 25 mmol/L glucose, 50 mmol/L glucose, Norvasc (25 nmol/L)+25 mmol/L glucose, or Norvasc (25 nmol/L)+50 mmol/L glucose for 48 h. The morphology of H9c2 cells was observed. The cell surface area was measured by Image-Pro Plus 6.1 software. Fluorescence spectrophotometry was used to detect the concentration of intracellular calcium ion ([Ca2+]i)in the cardiomyocytes. The concentration of CaN in the cell was measured by ELISA. The mRNA expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC in the cells was detected by real-time PCR. The protein levels of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC in cultural H9c2 cells were detected by Western blot. RESULTS: The mean area of the cells, the mean fluorescence value of [Ca2+]i and the concentration of CaN in 25 mmol/L glucose group were higher than those in 5 mmol/L glucose group, and those were lower than those in 50 mmol/L glucose group. After treated with Norvasc, those results decreased significantly. The expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC at mRNA and protein levels in 25 mmol/L glucose group was higher than those in 5 mmol/L glucose group, but was lower than those in 50 mmol/L glucose group . The expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC at mRNA and protein levels decreased significantly in Norvasc treatment group. CONCLUSION: Ca2+-CaN-NFAT3 signaling pathway is perhaps involved in high glucose- induced H9c2 cardiomyocyte hypertrophy.

[KEY WORDS]Gestational diabetes mellitus; Cardiomyocyte hypertrophy; Amlodipine; Calcineurin; Nuclear factor of activated T cells 3

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指“妊娠期或妊娠前發生的任何程度或首次識別葡萄糖耐受不良”[1]。GDM孕婦胎兒心臟畸形發生率高于一般孕婦胎兒6～8倍[2]，包括動脈導管未閉、肺動脈狹窄及室間隔肥厚等發育異常，其中心肌肥厚是心血管意外事件發生的獨立危險因素，可對胎兒的發育造成嚴重的不良后果，甚至影響其成年后的生活質量[3-4]。GDM孕婦所生的新生兒10%～20%可有心臟擴大，新生兒肥厚性心肌病的發生與孕婦血糖控制不理想有獨立相關性，超聲心動檢查顯示心肌肥厚，室間隔增厚，心臟擴大，嚴重者將會發生心力衰竭。高血糖致心肌病的特點是心肌結構改變，而最終導致心力衰竭的是心肌結構和功能的改變。目前認為多種機制參與其中，包括改變心肌能量代謝和鈣信號；但高血糖致胎兒心肌改變的具體機制尚不明確。本研究從鈣信號通路角度研究GDM中胎兒發生心肌肥厚的可能發病機制，以期為臨床防治此種疾病提供理論依據并發現可能作用靶點。

材料和方法

1材料

大鼠胚胎心肌細胞H9c2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；D-葡萄糖購自廣州化學試劑；絡活喜(Norvasc；即苯磺酸氨氯地平，amiodipine besylate)由Sigma提供；胎牛血清(HyClone)；DMEM高、低糖培養基(Gibco)；PBS磷酸鉀緩沖液(HyClone)；鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司；鈣離子熒光探針Fluo-3 AM(碧云天)；DNase I(RNase-free)、反轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(Vazyme)；鈣調神經磷酸酶Aβ(calcineurin Aβ，CaNAβ)、活化T細胞核因子3(nuclear factor of activated T cells 3，NFAT3)和β-重鏈肌球蛋白(β-myosin heavy chain，β-MHC) I 抗購自Abcam。

2方法

2.1細胞培養細胞解凍后，在含10%胎牛血清的DMEM培養液，5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中培養。

2.2實驗分組實驗共分為5組，分別為5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L糖處理組及Norvasc與25 mmol、50 mmol/L糖共處理組。

2.3細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)的測定Fluo-3經無血清DMEM培養基稀釋至2 μmol/L；去除舊細胞培養基，用PBS洗滌細胞，先后于37 ℃、5% CO2予2 μmol/L的Fluo-3孵育1 h、30 min；棄去Fluo-3，PBS洗滌細胞2次，加培養基適量后熒光顯微鏡檢測。

2.4細胞內CaN濃度的測定按酶聯免疫吸附測定試劑盒操作步驟操作。

2.5熒光定量PCR法檢測各組心肌細胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA表達用 TRIzol 試劑盒(Invitrogen)提取 RNA ；使用RNase-free的DNase Ⅰ配置反應液，37 ℃消化30 min，65 ℃滅活10 min去DNA，加入模板RNA、引物混合物42 ℃逆轉錄1 h，冰上2 min；cDNA稀釋10倍后，作為PCR模板加入引物反應體系，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s；40個循環，在溫度60 ℃、95 ℃行融解曲線分析。GAPDH的上游引物序列為5’-CATCAACGACCCCTTCATTG-3’， 下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGTTTCC-3’；CaNAβ的上游引物序列為5’-ATGTTGCCTAGTGGAGTGTT-3’， 下游引物序列為5’-GGAGAGTATCCTCGTATTGCTT-3’； NFAT3的上游引物序列為5’-CCACAAGGCATTGAGACACAT-3’， 下游引物序列為5’-TCACCAGCAGCAGCAGCAG-3’；β-MHC的上游引物序列為5’-AATGAACACCGGAGCAAGG-3’，下游引物序列為5’-CGGGTCAGCTGAGAGATAAGAGC-3’。

2.6Western blot檢測各組心肌細胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC蛋白的表達預冷的PBS沖洗培養孔板中的H9c2細胞后立即放入預冷的裂解緩沖液中30 min，裂解產物10 000 r/min離心20 min，取上清。吸取2 μL上清液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，制備10 mL 10% SDS-PAGE分離膠，凝固后配制5%濃縮膠5 mL灌滿剩余空間，每孔上樣50 μg。用100 V恒壓濃縮膠電泳20 min，恒壓140 V分離膠電泳40 min。將凝膠中已分離的蛋白質電轉移至PVDF膜上，TBS洗滌3次, 傾去TBS后加封閉液置搖床室溫封閉2 h；膜放入封閉液稀釋 I 抗中室溫反應4 h后4 ℃過夜，大量PBST洗膜3次，洗滌后將PVDF膜放入 II抗中室溫搖床2 h。取出PVDF膜, PBS洗5次, 每次15 min。ECL發光法顯影。

3統計學處理

采用GraphPad Prism 5行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，各組均數兩兩之間采用Bonferroni校正的t檢驗比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1細胞表面積分析

使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，可見各組不同條件分別培養48 h后，細胞大小隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L時達到最高點。加入Norvasc后細胞大小較相同條件不加Norvasc者降低，但與5 mmol/L glucose組比較，細胞大小改變的差異均無統計學意義，見圖1。

Figure 1.The mean surface area of the H9c2 cells in each group. The cells were treated with 5 mmol/L glucose (A), 25 mmol/L glucose (B), 50 mmol/L glucose (C), Norvasc+25 mmol/L glucose (D), or Norvasc+50 mmol/L glucose (E) for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖1各組細胞表面積大小的測量結果

2各組細胞內[Ca2+]i活性測定結果

各組不同條件分別培養48 h后，單細胞平均[Ca2+]i活性測定熒光值隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L時達到最高點(P<0.05)。加入Norvasc后單細胞平均[Ca2+]i活性測定熒光值較相同條件不加Norvasc者降低(P<0.05)，見圖2。

3各組細胞CaN濃度的測定

各組不同條件分別培養48 h后，其余各組CaN濃度均較5 mmol/L時糖濃度組升高(P<0.05)；CaN濃度隨糖濃度升高呈階梯上升(P<0.05)。加入Norvasc后CaN濃度較相同條件不加Norvasc者降低(P<0.05)，見圖3。

4Real-time PCR檢測各組H9c2細胞CaN、NFAT3和β-MHC mRNA的變化

各組不同條件分別培養48 h后，CaN、NFAT3及β-MHC的mRNA表達隨糖濃度升高呈階梯上升，50 mmol/L時表達最多。加入Norvasc后， CaN的mRNA表達均明顯降低，見圖4。

Figure 2.The fluorescence images of [Ca2+]iin the H9c2 cells with different treatments (×200) and the quantitative analysis of the mean fluorescence intensity of [Ca2+]iin each group. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖2各組[Ca2+]i熒光染色觀察和各[Ca2+]i熒光值的測定結果

5Western blot檢測各組H9c2細胞CaN、NFAT3和β-MHC蛋白的表達

各組不同條件分別培養48 h后，CaN、NFAT3及β-MHC蛋白表達隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L組達到最高點，差異有統計學意義。加入Norvasc后，各蛋白表達均明顯降低，見圖5。

討論

高血糖持續時間的長短是糖尿病心肌病造成心力衰竭嚴重程度的重要標尺[5]，故將高血糖作為造成糖尿病心肌損傷的獨立危險因素來研究[6]。H9c2細胞來源于大鼠胚胎心室肌克隆培養的心臟成肌細胞，有文獻證實氧化應激條件下H9c2細胞具有的應答反應相似于原代培養的乳鼠心肌細胞[7]。因其來源于大鼠胚胎的心肌細胞，更能直接反映胚胎心臟的生理病理狀態，所以我們用其來研究GDM中大鼠胚胎在持續高血糖環境下心肌細胞發生的可能改變。

CaN-NFAT3信號通路在心臟發育發展過程中發揮了重要作用。有研究人員[8]發現，CaN-NFAT3信號在小鼠胚胎E9即啟動了心臟瓣膜的形成過程，E11在心內膜中參與指導瓣膜狀小葉的重塑，這種連續的心肌層-心內膜信號協調了各種分子和細胞事件以確保瓣膜形成過程的起始和延續。相較CaN-NFAT3信號通路在胚胎心血管發育過程中的作用，其在心肌肥大中所扮演的角色則更受人關注，也了解得更為透徹。鈣調神經磷酸酶是由一個催化亞單位(CnA)和一個調節亞單位(CnB)組成的異二源體，在CnA的α、β和γ 3種亞型中，在心臟中介導鈣調神經磷酸酶活性與CnAβ亞型有關，與CnAα和CnAγ無關[9]。Ca2+/鈣調素(calmodulin，CaM)-calcineurin (CnAβ)-NFAT3組成鈣調神經磷酸酶信號通路。多項研究[10-11]認為:多種病因均能使心肌細胞質內Ca2+濃度增加，激活的Ca2+/CAM依賴的CaN，在依賴Ca2+和CaN的通路里去磷酸化胞漿中的轉移NFAT3，暴露其上的核定位信號，并需要GATA等配偶體的協助來完成核轉運[12]，轉位入細胞核，活化多種心肌肥大的相關基因調節心臟中的心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)、β重鏈肌球蛋白(β-MHC)等肥大基因特異性表達，導致心肌細胞蛋白核酸合成增加，心肌細胞體積增大，形成心肌肥大。

Figure 3.The concentration of CaN in the H9c2 cells with different treatments detected by ELISA. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖3ELISA測定各組細胞內CaN濃度的結果

Figure 4.The mRNA expression in the H9c2 cells with different treatments detected by real-time PCR. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖4Real-time PCR檢測各組H9c2細胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA表達

Figure 5.The protein levels in the H9c2 cells with different treatments detected by Western blot analysis. The definition of the grouping was the same as Figure 1. β-actin is the same.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖5Western blot檢測各組CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的蛋白表達

細胞內游離鈣作為第二信使廣泛參與細胞生理活動的調節過程。鈣離子濃度對于該信號通路的影響是顯而易見的，Somvanshi等[13]提供了直接的證據證明生長抑素受體2(somatostatin receptor-2，SSTR2)通過調節Ca2+相關的致心肌肥厚的信號途徑來保護心臟。Hsu等[14]發現壓力超負荷早期釋放心肌肥厚早期的信號Egr1(early growth response 1)誘導Cav3.2通過鈣調神經磷酸酶-NFAT信號通路調節心肌肥大。我們選擇用不同濃度的葡萄糖培養H9c2來探索高糖對其存活、生長的可能影響，并利用加入L型鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平來探討Ca2+在其中的可能作用及主要信號途徑，以期探索并發現影響胎兒心臟發育的關鍵影響因素并提供可能的治療干預對策，爭取為以后臨床發展提供理論依據。

我們的研究發現高糖可導致H9c2細胞平均單個細胞體積增加，為進一步研究這種肥大可能通過何種信號通路來完成，我們檢測了其中的CaNAβ、NFAT3及β-MHC的mRNA及蛋白表達，并采用ELISA檢測CaN總的蛋白表達，發現它們的變化趨勢一致，均隨培養糖濃度的增加而增加，并隨濃度進一步增高而增高，提示兩者具有相關性。因已有的認識證明CaN的激活主要依賴胞漿內Ca2+濃度的升高，它的活性受細胞內Ca2+的變化所調節，所以鈣離子通道抑制劑也是目前心肌肥厚一個研究熱點和重要的治療靶點。L型鈣通道抑制劑Norvasc被用來反證高糖培養的H9c2細胞中Ca2+是否存在內流，引起[Ca2+]i的變化并激活CaN，從而激活信號通路最終致心肌細胞肥大。我們發現，使用Norvasc后細胞內鈣活性明顯降低，CaN濃度明顯降低及CaNAβ、NFAT3及β-MHC的mRNA及蛋白表達也明顯降低，提示Ca2+參與了CaNAβ-NFAT3信號通路的激活，Ca2+尤其是細胞內鈣在高糖培養致H9c2細胞肥大中可能發揮了重要作用。但心肌肥大的信號轉導機制非常復雜， Liu等[15]提供了與LPS誘導的炎癥反應和鏈接的CaN-NFAT3信號轉導通路介導心肌肥厚發展的相關證據，他們使用了信號通路中多個關鍵點的抑制劑，證明鈣調磷酸酶抑制劑顯著抑制了NFAT3核定位，證實了LPS通過CaN-NFAT3 信號轉導通路導致H9c2細胞的心肌肥厚。該研究提供了我們下一步研究的思路。

總而言之，根據我們的研究，有理由認為高糖培養可能通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路而導致H9c2細胞肥大，鈣離子通道抑制劑Norvasc可以抑制這種作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)