長鏈非編碼RNAs的生物功能及其與器官發育和惡性腫瘤的關系*

張明嬌， 吳 勇， 李珉珉

(暨南大學附屬第一醫院臨床醫學檢驗中心，廣東廣州510632)

在組成人類的約30億個堿基對中，蛋白編碼序列只占1.5%，而其余不編碼蛋白質的序列曾一度被認為是基因組進化過程中的“垃圾序列”。2013年發布的ENCODE研究數據表明，所謂的“垃圾序列”絕大多數被轉錄成分子長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼 RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)。隨著高通量檢測技術的發展，lncRNAs的面紗逐漸被揭開，并根據其與編碼基因的位置關系可分為正義、反義、基因間等6類［1］。lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生，不具有或少有開放閱讀架 (open reading frame，ORF)，在多種層面調控包括細胞分化和個體發育在內等的重要生命進程，其異常表達還與多種人類重大疾病密切相關。本文結合國內外lncRNAs的研究現狀，對其生物學功能，包括對基因表達的調控功能、在細胞分化和個體發育中的作用及其與常見惡性腫瘤的關系進行綜述。

1 lncRNAs的自身表達調控

目前認為lncRNAs主要來源于下列途徑:蛋白編碼基因在多種因素下斷裂形成lncRNAs;非編碼基因通過反轉錄產生沒有功能的非編碼反轉錄假基因lncRNAs;染色質發生重排后過程中，2個不轉錄且相隔較遠的序列合并產生lncRNAs;小非編碼RNA中的某段序列多次復制形成;轉錄因子中插入一段序列形成［2］。LncRNAs具有廣泛的組織和細胞表達譜，越來越多的證據顯示，在真核細胞內lncRNAs被普遍轉錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能。lncRNAs與蛋白編碼基因相比具有更強的組織和細胞表達特異性，如它們在小鼠胚胎干細胞分化過程中特異表達，而在小鼠大腦中具有亞細胞精確定位功能［3］。LncRNAs還具有不同的表達模式，對大量組織和細胞都有調節作用，并且在一些疾病中其表達水平會發生變化，這涉及到許多重要的生物學過程。

2 lncRNAs調控基因表達的多種作用形式

2.1 lncRNAs的表觀遺傳學的調控 Xist RNA是最早被發現調控X染色體失活的lncRNAs，主要機制為Xist RNA與即將沉默的染色體區域結合形成“沉默區間”，以此招募多梳蛋白抑制物復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)，通過抑制組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation，H3K27me3)的刺激因素導致X染色體沉默，從而調控細胞的增殖和分化。近年有研究發現［4］，Xist基因可作為唐氏綜合癥的治療靶點，這一發現預示著lncRNAs可用于疾病治療尤其是在再生醫學領域。此外，由HOX基因轉錄本的反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)同樣能夠招募PRC2并將其定位到HOXD位點，進而誘導HOXD位點的表觀遺傳沉默［5］。

2.2 lncRNAs的順式調控作用 由蛋白編碼基因增強子區轉錄的lncRNAs稱e-RNAs，這類lncRNAs具有類似增強子的功能，通過招募轉錄激活因子與其形成復合體，增強鄰近靶基因的表達。由HOXA基因家族轉錄的Hottip lncRNA可進入HOXA基因簇形成的染色質環內，與MLL-WDR5復合體結合使其到達HOXA基因，刺激該區組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化(histone H3 lysine4 trimethylation，H3K4me3)，進而促進HOXA下游基因的轉錄［6］。作為bHLH轉錄因子家族成員neurogenin 1，其表達依賴于 utNgn1 e-RNA的表達，而utNgn1 e-RNA編碼neurogenin 1基因轉錄起始位點上游7 kb的區域。多梳家族蛋白(polycomb group proteins，PcG)可以抑制utNgn1 e-RNA及neurogenin 1的表達，并且敲低utNgn1后可直接導致neurogenin 1的表達量減少［7］，這一現象提示neurogenin 1的表達受utNgn1 e-RNA表達水平的順式調控。

2.3 lncRNAs的反式調控作用 B2 lncRNA通過與RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結構域(C-terminal domain，CTD)結合，通過阻止其磷酸化來抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性，從而影響整體轉錄水平。研究表明B2 lncRNA受到壓力信號刺激時表達上調，阻止一切轉錄活動，提示這可能是作為細胞保護的一種機制［8］。類固醇受體激活物(steroid receptor activator，SRA)是在RNA轉錄和蛋白質表達2個水平上發揮功能的分子。SRA基因編碼的lncRNA主要參與核受體的轉錄共激活作用［9］。除了核受體，SRA還可以促進不同細胞和生長環境中P53及MyoD的轉錄活性。SRA lncRNA的過表達連同MyoD一起能促進小鼠成纖維細胞向骨骼肌的橫向分化，而類固醇激素受體共激活蛋白質 (steroid receptor activator protein，SRAP)則通過結合SRA RNA阻止其與MyoD作用，進而影響肌細胞分化［10］。這是1種基因編碼2種產物對轉錄有相反作用的典型例子:一個起促進作用的lncRNA和一個起抑制作用的蛋白質。

2.4 lncRNAs在可變剪接中的調控 研究還發現，多種lncRNAs是可變剪接的調控因子。肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript l，MALAT1)的lncRNA已被發現與多種腫瘤形成、轉移以及預后不良有關［11-13］。MALAT1位于多種細胞系的核剪接斑點(splicing speckle)，通過與絲氨酸/精氨酸(serine/arginine，SR)剪接因子相互作用來調控剪接因子在剪接斑點中的分布和磷酸化水平，從而改變mRNA前體的可變剪接模式。Bemard等［14］研究發現MALAT1在神經細胞中高表達，并同樣通過調控SR剪接因子影響突觸相關基因表達。

2.5 競爭性內源lncRNAs“miRNAs海綿”已逐漸發展成為一種研究策略，在此策略中設計富含多個針對特定miRNAs靶向位點的外源性RNA分子，通過吸附細胞中miRNAs來解除其對靶基因的負性調控作用。最近的研究報道了自然存在的“miRNAs海綿”，稱它們為競爭性內源RNAs(competing endogenous RNAs，ceRNAs)［15］。其中，linc-MD1 作為 ce-RNAs之一，能結合miR-133和miR-135，從而解除其對編碼重要肌源性因子的靶基因的調控，進而激活細胞分化相關基因表達。相反，如敲低linc-MD1基因，則細胞分化進程延遲。在臨床上，杜氏肌營養不良癥患者的成肌細胞中，linc-MD1水平顯著降低［16］。最近，有研究報道［17］內源性環狀 RNAs(circular RNAs，circRNAs)分子在不同物種中起到”miRNAs海綿”的作用，miR-7環狀RNA海綿(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)包含豐富的選擇性保守miRNAs靶位點，它在人類及小鼠大腦組織中廣泛表達，通過抑制miR-7活性而導致miR-7靶基因水平增加。以上研究發現表明，ceRNAs可以調控不同的生物學功能，并且揭示這些lncRNAs內部的相互作用機制可以為大部分的分化和病理進程提供重要的信息。

3 lncRNAs與細胞分化和組織器官發育

3.1 干細胞多能性與分化 一些lncRNAs已被研究確認參與維持誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)及人和鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)的多能性，并且這些lncRNAs的表達譜與控制多能性網絡調控有關的核心因子OCT4、NANOG、SOX2明顯相關，功能缺失試驗可以導致干細胞分化而失去多能性，或者譜系定向基因表達譜的上調［18］。在眾多的多能性相關 lncRNAs中，linc-RoR(long intergenic noncoding RNA，regulator of reprogramming)在iPSCs中含量豐富，它充當一個關鍵性 ceRNA，競爭性結合 miR-145而保護OCT4、SOX2和NANOG轉錄本免受miR-145的負性調控。抑制其表達，可顯著降低細胞重編程的效率［19］，提示轉錄因子、miRNAs、lncRNAs在譜系定向過程中能形成彼此調控的網絡。

3.2 心臟發育 有大量lncRNAs參與心肌細胞發育過程，lncRNA Bvht和lncRNA Fendrr首先在小鼠中胚層細胞中發現，對心臟發育具有重要作用。Bvht在胚胎干細胞中已開始表達，經RNA干擾技術介導的敲除小鼠胚胎干細胞Bvht后，明顯影響心肌特異性基因表達水平，并阻止其分化為成熟的具有搏動能力的心肌細胞，其機制可能是Bvht可以上調一些在新生中胚層發育為心肌細胞過程中起關鍵作用的轉錄因子，如中胚層后蛋白(mesoderm posterior 1，MesP1)［20］，提示 Bvht可能參與心肌受損后的組織重塑。此外，Bvht也能通過與染色質修飾復合物SUZ12結合在表觀遺傳學水平發揮調控作用。Fendrr則是小鼠側板中胚層特異表達的一種lncRNA，在體內經RNA干擾技術降低60%的表達水平，并未顯示明顯表型改變。相反，如果敲除小鼠胚胎Fendrr，心肌細胞數量發生明顯減少，心室壁變薄，最終導致胚胎死亡［21］，提示心肌細胞數目的減少可能因為側板中胚層向心肌細胞分化受阻所致。總之，Bvht與Fendrr在心臟發育中具有重要調控作用，使心肌細胞分化有序進行。

3.3 大腦和中樞神經系統發育 大腦的基因表達通常與lncRNAs有關，其中包括與大腦發育密切相關的Dlx基因家族。Guttman等［22］通過分析包括神經前體細胞在內的小鼠神經元染色質標簽，發現了大于1 000個保守的基因間lncRNAs，功能分析顯示，這些lncRNAs與小鼠海馬發育、少突膠質細胞髓鞘形成、GABA能神經元分化、G蛋白偶聯受體介導的信號轉導通路及鈣調神經磷酸酶依賴的信號轉導通路有關。

此外，lncRNAS還參與到脂肪細胞分化、骨骼肌及視網膜等器官和組織發育等過程。

4 lncRNAs與常見惡性腫瘤的關系

在多細胞生物體內，lncRNAs作為激活或抑制因子廣泛參與到細胞分化和個體發育進程。腫瘤為脫分化的細胞惡性增殖，理論上與這些廣泛參與到細胞分化和個體發育的lncRNAs有密切關系。腫瘤相關lncRNAs的研究正在興起，已有研究證實lncRNAs在腫瘤生物學中具有重要功能，并且在多種腫瘤中調控失調，可作為相關腫瘤早期診斷和預后判斷的重要分子生物標志物，也可為腫瘤復發、轉移治療提供新的靶點和治療思路。

HOTAIR作為組蛋白修飾復合物的支架可結合PRC2及組蛋白去甲基化酶復合體，并介導這2種復合體至特定基因位點，導致H3K27me3，從而使腫瘤轉移抑制基因(如JAM2、PCDH10和PCDHB5)在表觀遺傳水平上發生沉默。HOTAIR表達水平與乳腺癌、肝癌、結直腸癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤的發生發展、轉移及預后密切相關［23］。Sorensen 等［24］研究發現HOTAIR在乳腺癌原發灶及其轉移灶組織中的表達明顯不同，且轉移灶組織中HOTAIR普遍高表達。進一步的生存分析研究發現，相比于低表達患者，HOTAIR高表達患者的無轉移生存率明顯降低。多因素分析顯示，HOTAIR的高表達是預測病人無轉移生存率危險因素之一，且獨立于其它危險因素，如年齡、腫瘤大小、臨床分期以及雌激素受體表達等。因此HOTAIR可預測乳腺癌的轉移，并且與患者不良預后密切相關。Ishibashi等［25］通過熒光定量 PCR方法檢測64名肝癌患者中HOTAIR表達情況，并與HOTAIR低表達患者相比，結果發現HOTAIR高表達患者總體生存率低、腫瘤體積更大，提示HOTAIR可促進肝癌細胞增殖并且可作為肝癌預后的危險因素。盡管眾多研究表明HOTAIR與腫瘤的發生發展有密切關系，但其具體作用機制還有待進一步探究。

印記基因H19是較早發現的一種lncRNA，既有致癌作用，也有抑癌作用。H19在胃癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等中表達均異常。Li等［26］用lncR-NAs微陣列芯片技術檢測74對患者胃癌和癌旁組織發現，與正常的癌旁組織相比，H19在胃癌組織的表達明顯上調，且平均差異水平超過6倍，并且生存分析顯示高水平H19患者比低水平者預后較差，表明H19有望成為預測胃癌患者生存期的新型生物標志物及新治療靶點。H19的第1個外顯子可轉錄出miR-675。Zhu等［27］研究中發現，相比非前列腺癌轉移細胞株P69，印記基因H19及mir-675在前列腺癌轉移細胞株M12中的表達水平明顯下調，并且抑制參與腫瘤轉移的細胞外基質蛋白——生長因子β誘導蛋白(transforming growth factor β-induced protein，TGFBI)的合成，可見H19還有抑制腫瘤轉移的作用。H19這種雙向調控機制是源于自身特性，還是與環境因素的共同作用，仍需進一步研究。

結腸癌相關轉錄本1(colon cancer-associated transcript 1，CCAT1)在結腸癌組織中表達高度上調。Nissan等［28］通過代表性差異分析發現 CCAT1在結腸癌組織中表達水平高于正常黏膜組織235倍，并且在病人外周血單個核細胞中的表達水平同樣高于正常人，提示CCAT1有望成為結腸癌診斷的標志物。Mizrahi等［29］通過熒光定量PCR技術檢測19例胃癌組織﹑癌旁組織及正常胃黏膜組織的CCAT1表達水平發現，其在胃癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，差異有統計學意義，提示CCAT1可作為胃癌早期診斷與監測的生物標志物。也有研究［30］發現CCAT1在膽囊組織中表達上調，并通過結合miR-218-5p來解除其對靶基因Bmi1的負性調控，從而促進腫瘤細胞形成。

隨著高通量測序技術的發展，越來越多腫瘤相關lncRNAs被發現。Peng等［31］通過熒光定量PCR方法檢測肝細胞癌組織及細胞系中lncRNA PANDAR表達情況，結果發現其在肝癌組織中表達水平高于正常癌旁組織，ROC為0.9564，提示 lncRNA PANDAR有望作為肝細胞癌診斷的潛在標志物。目前已發現體液中多種lncRNAs可作為腫瘤篩查、診斷的生物標志物，例如血液中lncRNA POU3F3可作為食管鱗癌的診斷指標，其與SCCA聯合檢測對于食管鱗癌的早期篩選更有意義;lncRNA PCA3在前列腺癌中表達上調，尿液中PCA3可作為前列腺癌的早期診斷標志物，小干擾RNA介導的PCA3表達下調能明顯抑制前列腺癌細胞的增長和靶基因的表達［32］，提示lncRNA PCA3可能作為前列腺癌的治療靶標;尿液lncRNA-UCA1診斷膀胱癌的敏感性和特異性分別為91.5%和96.5%［33］，ROC為0.975，提示尿液lncRNA-UCA1有望成為膀胱癌的早期篩查指標。相比于腫瘤組織，體液更易獲取和檢測，因此，體液lncRNAs有潛力作為腫瘤特異標志物應用于臨床，并與其它腫瘤標志物相結合對腫瘤進行篩查、早期診斷和鑒別診斷，對患者療效和預后進行評估。

lncRNAs調控失調對腫瘤發生﹑發展的影響見表1。

表1 疾病相關lncRNAsTable 1.Disease-associated lncRNAs

5 總結與展望

目前在lncRNAs研究中較成熟的技術包括熒光原位雜交﹑Northern印跡﹑實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應、RNA干擾﹑RNA結合蛋白免疫沉淀、微陣列和RNA-Seq高通量測序，以及近年出現的新技術，如快速預測 RNA與蛋白質相互作用的catRAPID、RNA純化的染色質分離技術等。新技術的出現為疾病的診斷及治療帶來希望。盡管對于lncRNAs的研究得到快速發展，仍有大量基礎和應用問題亟待解決。明確lncRNAs在不同類型細胞分化和個體發育過程中的調控機制，將是基礎研究中的核心問題。目前關于lncRNAs在疾病中的證據大多來自于表達水平上的差異，解析它們與疾病發生的因果關系和作用機制，將有可能為疾病的診斷和治療提供新的靶點和依據。另外，針對不同lncRNAs的結構及作用方式設計新的研究技術體系也即將成為未來重要的研究方向。

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