重復經顱磁刺激對抑郁模型大鼠學習記憶功能及海馬CA3區突觸素表達的影響*

歐陽華，白 冰，趙 琳，任慧聰，張朝輝#

1)新鄉醫學院第二附屬醫院心身疾病二科新鄉453002 2)新密市第一人民醫院神經內科新密452370

(2014-11-20收稿 責任編輯 王 曼)

海馬突觸的可塑性變化在抑郁癥的發病和治療方面有著至關重要的地位。研究［1］表明抑郁癥與一些腦區的功能和結構的可塑性損傷有關，尤其是海馬區。抑郁癥與突觸的萎縮及突觸聯系的減少有關聯，而且這些神經性改變是抑郁癥患者與海馬相關的認知缺損的基礎［2］。大量研究［3-4］表明，海馬與學習記憶(特別是空間認知功能)有關，CA3區被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系尤為密切，如CA3區損傷可導致學習及記憶功能障礙。重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是在經顱磁刺激基礎上發展起來的一項新型神經電生理技術［5］。近年來國內外研究［6-7］均表明rTMS在一定程度上能夠改善抑郁癥患者的認知功能障礙，但是其確切機制尚不完全明確。突觸素(synaptophysin，SYP)是突觸前區中重要的囊泡蛋白之一，對于突觸的形成和分泌是必需的。其表達可間接反映突觸的數量、密度和分布情況，是突觸可塑性的重要標志之一［8］。該研究通過給予抑郁模型大鼠rTMS，觀察大鼠學習記憶功能、海馬CA3區SYP的表達水平的變化，探討rTMS對抑郁大鼠學習記憶功能的影響及其可能的突觸可塑性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 通過頻數表和箱式圖來判斷個體的行為學分數，按照統計學對離群數據的處理方法，篩選出評分均一、同質性較高的雄性SD大鼠(SPF級)40只，體重200～250 g，6～8周齡，由河南省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(豫)2010-0002，質量合格證號:1009570。

1.2 實驗分組及處理方法 利用隨機數字表法將大鼠隨機分為4組:rTMS組、偽刺激組、抑郁組及對照組，每組10只。除對照組外，其余3組大鼠均參考文獻［9］采用孤養結合慢性不可預見輕度應激制備抑郁模型并進行模型評估。接受建模處理的大鼠孤養在獨立的籠內，在21 d內接受不同的應激，應激包括禁食24 h、禁水24 h、40℃高溫5 min、足底電刺激5 min、夾尾2 min、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒24 h，7種應激隨機安排，1種/d，每種應激出現3次，同種應激不能連續出現，使動物不能預料應激的發生。采用蔗糖水消耗實驗及曠場實驗進行模型評估。rTMS組大鼠在造模成功后24 h行rTMS治療。采用武漢依瑞德公司生產的CCY-Ⅰ型磁刺激儀及環形動物線圈，線圈直徑約70 mm。刺激時固定大鼠頭部，線圈緊貼頭皮，與大鼠左側半球相切，線圈中心與大鼠額頂葉皮質體表投影區中心重合，刺激頻率15 Hz，刺激量在100%MT，每天20串，每串80個脈沖，間歇10 s，共1 600次脈沖，連續5 d為1個療程，療程間隔2 d，共3個療程。偽刺激組置于相同的環境，線圈不通電，即無電流脈沖，只施予同樣次數的聲音刺激。

1.3 學習記憶功能的檢測 rTMS干預后，采用Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶功能。參照Brightwell等［10］的方法，并結合課題做了部分改動。測試程序主要包括定位航行和空間探索實驗兩個部分。①定位航行實驗:連續訓練4 d，2次/d，間隔8 h，每個訓練時段4次，分別從四個象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在水中尋找并爬上平臺的時間(即逃避潛伏期)，停留2 s為找到平臺。如果大鼠在90 s內找不到平臺，將其引導至平臺，并在上面停留30 s，此時的逃避潛伏期記錄為90 s。以4 d內的平均值作為學習成績。②空間探索實驗:于rTMS干預后第5天撤去平臺，于第一象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在2 min內的運動軌跡，分析其在原平臺象限游泳時間及在原平臺象限游泳路程占總游泳路程的百分比，將其作為大鼠的記憶成績。

1.4 海馬SYP蛋白表達的檢測 在水迷宮測試結束后1 d內，各組隨機選取6只大鼠，麻醉后多聚甲醛灌流內固定，切取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，置于多聚甲醛溶液中4℃過夜，再于蔗糖水溶液中4℃梯度脫水，最后用OCT組織包埋劑將整個大腦包埋成形，于－70℃保存備用。SYP蛋白表達的檢測采用免疫組織化學SABC法。一抗SYP及生物素標記的二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照。采用Leica Application Suite圖像采集系統，在400倍視野下對海馬 CA3區拍照，并用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定每張圖片中陽性染色區域的平均光密度值，取同一只大鼠6張圖片的平均值表示海馬SYP蛋白的表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0進行統計學分析。4組學習成績、記憶成績、海馬SYP蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 4組大鼠水迷宮測試結果 見表1。在定位航行實驗中，與對照組相比，rTMS組、偽刺激組、抑郁組的逃避潛伏期均延長，但rTMS組短于偽刺激組、抑郁組。在空間探索實驗中，4組大鼠的運動模式明顯不同。對照組大鼠探究能力更強、活動范圍更廣，均能快速地找到并爬上平臺;而抑郁組和偽刺激組大鼠活動范圍小，主要沿水迷宮周邊游動，較少向內探索，找到平臺的時間較長，在原平臺象限游泳時間縮短，在原平臺象限游泳路程占總路程的百分比減小;rTMS組較抑郁組和偽刺激組大鼠明顯改善，在原平臺象限游泳時間及原平臺象限游泳路程占總路程的百分比較偽刺激組、抑郁組明顯延長和增大。

表1 4組大鼠水迷宮測試結果的比較

2.2 4組大鼠海馬SYP蛋白表達水平的比較 見圖1、表2。海馬CA3區SYP免疫反應陽性產物呈板層樣分布于輻射層和始層的神經氈內，呈棕黃色點狀或顆粒狀，顆粒的大小與突觸類型及免疫反應強弱有關。與對照組比較，抑郁組、偽刺激組CA3區SYP蛋白表達水平降低;與抑郁組、偽刺激組比較，rTMS組CA3區SYP蛋白表達水平升高，達對照組水平。

圖1 大鼠海馬CA3區SYP的表達(SABC，×400)A:對照組;B:抑郁組;C:偽刺激組;D:rTMS組。

表2 4組大鼠海馬CA3區SYP蛋白的表達

3 討論

rTMS的高場強磁脈沖信號可以連續不斷地透過顱骨，直接作用于大腦單側某一特定的皮質部位，從而改善及調節腦功能［6］。該技術已在神經、心理、精神等各個研究領域被廣泛應用。研究［7］表明rTMS干預不會進一步惡化抑郁癥患者的認知功能，反而可以提高患者的工作執行能力及客觀記憶力。既往Ahmed等［11］研究發現15 Hz的rTMS可以改善大鼠在新事物識別方面的能力。Tan等［12］發現1 Hz為期3周的rTMS治療可增進抑郁大鼠的空間參考記憶功能。該研究發現，rTMS干預能顯著改善抑郁大鼠學習記憶功能，與既往文獻報道結果一致。

SYP存在于突觸囊泡終端神經鞘，構成突觸囊泡特異性膜通道，被認為對突觸的可塑性是必需的［13］。該研究結果顯示，抑郁組大鼠海馬SYP蛋白表達水平較對照組降低，提示抑郁組大鼠海馬神經元突觸數量減少，其可塑性受到影響。Kim等［14］研究表明慢性應激可引起大鼠大腦結構和功能的改變，尤其可導致海馬CA3區錐體神經元樹突的萎縮，表現為大鼠海馬區 SYP 表達下調［15］。研究［16］顯示大鼠海馬神經元缺血后變性壞死，學習和記憶功能下降，SYP陽性產物表達水平也明顯降低，提示SYP與學習記憶關系密切。宿寶貴等［17］研究發現，經Morris水迷宮測試訓練后大鼠空間辨別性學習記憶功能明顯增強，SYP蛋白的表達水平明顯增加，說明空間辨識性學習記憶活動可引起突觸的形態可塑性變化，SYP表達與學習記憶功能有直接關系。Sze等［18］研究表明，SYP蛋白的缺失與阿爾茲海默病認知功能的減退密切相關。該研究結果表明，對抑郁模型大鼠進行高頻rTMS治療后，大鼠的學習記憶功能明顯改善，同時海馬CA3區SYP蛋白表達水平上調，提示rTMS干預可改善抑郁大鼠學習記憶功能障礙，該作用可能與海馬CA3區SYP的表達改變有關。

rTMS對抑郁癥認知功能障礙的治療效果雖然顯著，但還有許多問題亟待解決。海馬的學習記憶功能是通過海馬神經環路實現的，該研究只對其中一部分進行了研究，因此，今后可運用電生理技術進一步探討rTMS改善認知功能障礙的作用機制，并深入探索rTMS獨特的作用機制和引起的生物學效應及分子水平的變化。

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