丁苯酞對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡的影響

張曉璇 邱海鵬

河北承德附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 承德 067000

近年來，缺血性腦卒中的發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重威脅著人類的健康，腦缺血再灌注損傷對該類疾病的預(yù)后具有較大的影響，細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要病理基礎(chǔ)。丁苯酞（dl－3n－butylphthalide，NBP）對缺血性腦卒中具有較好的臨床效果，能從多條途徑改善患者的臨床癥狀。bcl－2、bax和caspase－3對細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)控作用，可導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生而引起凋亡［1－2］。筆者通過造腦缺血再灌注損傷模型，探討丁苯酞對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡因子bcl－2、bax和caspase－3表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和處理SD 雄性大鼠共108 只，體質(zhì)量（250±20）g，購置于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，隨機分為假手術(shù)組、模型組和丁苯酞組，丁苯酞組，每組36只，大鼠在造模前3d以80mg／（kg·d）的劑量給予丁苯酞，其他組大鼠給予同劑量的生理鹽水。使用大腦中動脈內(nèi)線栓阻斷法制造腦缺血再灌注模型，造模成功2h后拔除線栓，再灌注24 h。每組使用12只用于神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，12只用于TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，12只用于bcl－2、bax和caspase－3表達(dá)的檢測。

1.2 神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、凋亡細(xì)胞和免疫組化處理缺血2h再灌注24h后麻醉并開胸，右心耳放血并使用生理鹽水灌流，最后用多聚甲醛灌注固定，取腦組織，制作石蠟切片，蘇木精－伊紅染色，使用透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。并使用TUNEL染色觀察凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞特征：濃聚并集聚的核染色質(zhì)，有凋亡小體存在；使用SpectrumSee醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞進行計數(shù)，凋亡細(xì)胞指數(shù)（AI）＝［（凋 亡 細(xì) 胞 數(shù)／總 細(xì) 胞 數(shù)）100%］。bcl－2、bax 和caspase－3免疫組化試劑盒購置于上海美軒生物科技有限公司，陽性細(xì)胞判斷：bcl－2胞漿和胞膜呈棕黃色著色；bax胞漿呈棕黃色著色；caspase－3細(xì)胞質(zhì)、胞核呈棕黃色著色。使用BandScan圖像分析軟件計算各免疫組化結(jié)果的積分光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，行t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異假手術(shù)組：規(guī)則的細(xì)胞形狀，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的圓形或棒槌形線粒體，有較整齊的內(nèi)嵴，且清晰呈現(xiàn)，無空泡變性，散在分布有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，密集的核糖體依附其上，核規(guī)則且圓，有完整的核膜，有明顯的核仁，染色質(zhì)均勻，具有較高的電子透明度。模型組：不規(guī)則的細(xì)胞外形，線粒體內(nèi)嵴出現(xiàn)斷裂、減少、甚至消失，有大量空泡存在，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體出現(xiàn)較多的脫落，胞質(zhì)內(nèi)存在高電子密度顆粒，核膜發(fā)生崩解，染色質(zhì)聚集且靠邊。丁苯酞組：腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷輕于模型組，大部分線粒體膜較完整，空泡少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)較正常，高電子密度顆粒較少，染色質(zhì)出現(xiàn)輕度聚集，核仁可見。

2.2 各組腦組織凋亡細(xì)胞指數(shù)的差異假手術(shù)組、丁苯酞組和模型組凋亡細(xì)胞指數(shù)依次升高，各組間相互比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腦組織凋亡細(xì)胞指數(shù)的差異 ±s）

表1 各組腦組織凋亡細(xì)胞指數(shù)的差異 ±s）

注：與模型組比較，t＝34.957，＊P＝0.000；與丁苯酞組比較，t＝25.602，＃P＝0.000；與丁苯酞組比較，t＝11.351，＆P＝0.000

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2.3 各 組 腦 組 織bcl－2、bax 和caspase－3 的 差 異假 手 術(shù)組、丁苯酞組和模型組bax和caspase－3依次升高，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組、模型組和丁苯酞組bcl－2 依次升高，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組腦組織bcl－2、bax和caspase－3積分光密度值比較 ±s）

表2 各組腦組織bcl－2、bax和caspase－3積分光密度值比較 ±s）

注：與模型組比較，t＝15.775、10.384、23.745，aP＝0.000、0.000、0.000；與 丁 苯 酞 組 比 較，t ＝19.805、6.679、16.437，b P＝0.000、0.000、0.000；與 丁 苯 酞 組 比 較，t＝5.502、3.456、8.333，c P＝0.000、0.001、0.000

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3 討論

缺血性腦血管疾病（ischemic cerebral vascular disease，ICVD）急性期的血液存在中斷，神經(jīng)細(xì)胞在缺血缺氧的環(huán)境中，導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝發(fā)生異常，及時恢復(fù)缺血腦區(qū)的血液供應(yīng)對該類疾病的治療極為重要，但腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）對患者的預(yù)后也存在巨大的影響，如何預(yù)防缺血性腦血管疾病腦缺血再灌注損傷的發(fā)生成為該類疾病研究的新重點［3］。神經(jīng)元凋亡對腦缺血再灌注損傷的程度具有較大的影響，防止細(xì)胞凋亡成為減少缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。

凋亡相關(guān)蛋白含量的變化在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl－2是一類膜整合蛋白，存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜上，其對細(xì)胞凋亡具有較強的抑制作用，其在缺血過程中表達(dá)增加，但時間超過24h后其表達(dá)逐漸降低，其濃度的升高可對神經(jīng)細(xì)胞形成保護作用［4］。bax蛋白是一類促凋亡蛋白質(zhì)，存在于胞內(nèi)膜、胞漿和細(xì)胞核，具有促進細(xì)胞凋亡的作用，其通過形成二聚體而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其含量增加可增加線粒體的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放入胞增多，引發(fā)細(xì)胞凋亡［5］。Caspase－3是白介素－1轉(zhuǎn)換酶家族中的一員，是一類半胱氨酸蛋白酶，其可以和天冬氨酸殘基發(fā)生結(jié)合并進行剪切，其是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者和關(guān)鍵蛋白酶［6］。正常情況下，Caspase－3是以無活性的狀態(tài)下存在的，凋亡信號可使Caspase－3激活，形成了細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，形成凋亡底物。Caspase－3的存在是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路，對DNA 裂解修復(fù)功能具有重要影響。

丁苯酞是一類消旋體，在芹菜籽中存在其左旋體。丁苯酞可改變腦血流動力學(xué)，促進缺血區(qū)腦組織的血供，對腦組織的微循環(huán)具有改善作用［7］。丁苯酞對腦缺血期線粒體膜流動性具有調(diào)節(jié)作用，能穩(wěn)定線粒體膜電位，改善神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝，對自由基的生成也有抑制作用［8］。

本研究中，丁苯酞組腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷輕于模型組，大部分線粒體膜較完整，空泡少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)較正常，高電子密度顆粒較少，染色質(zhì)出現(xiàn)輕度聚集，核仁可見，假手術(shù)組、丁苯酞組和模型組凋亡細(xì)胞指數(shù)依次升高（P＜0.05），說明丁苯酞能穩(wěn)定缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。假手術(shù)組、丁苯酞組和模型組bax 和caspase－3依次升高（P＜0.05），假手術(shù)組、模型組和丁苯酞組bcl－2依次升高（P＜0.05），說 明 丁 苯 酞 能 降 低bax 和caspase－3 水平，增加bcl－2水平，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。焦東亮等［9］研究認(rèn)為，丁苯肽對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制caspase－3 表達(dá)相關(guān)。李國前等［10］研究認(rèn)為，丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與上調(diào)Bcl－2 的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)有關(guān)。蔣亮亮等［11］研究認(rèn)為，丁苯酞對在體外模擬腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的保護作用可能與其抑制Caspasce－3表達(dá)，下調(diào)bax／bcl－2比值有關(guān)。

綜上所述，丁苯酞能穩(wěn)定腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞凋亡減少，其發(fā)揮藥效可能是通過增加bcl－2的表達(dá)，降低bax和caspase－3水平實現(xiàn)調(diào)節(jié)。

［1］ 李延可，劉寧，谷有全，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦程序性凋亡因子－5表達(dá)的影響［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2012，15（10）：6－9.

［2］ 陳曉春.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元形態(tài)和BaxmRNA 表達(dá)變化的影響［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，49（2）：10－12.

［3］ 張培蕾，魯海濤，朱悅奇，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.介入放射學(xué)雜志，2012，21（3）：239－242.

［4］ 李其富，陳志斌，王淑榮，等.丁基苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl－2表達(dá)的影響［J］.華西藥學(xué)雜志，2011，26（4）：325－327.

［5］ Wang YG，Li Y，Wang CY，et al.L－3－n－butylphthalide protects rats＇cardiomyocytes from ischaemia／reperfusion－induced apoptosis by affecting the mitochondrial apoptosis pathway［J］.Acta Physiol，2014，210（3）：524－533.

［6］ 周小琳，于首元.丁苯肽軟膠囊對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積和神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白bcl－2，caspass－3表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2009，26（5）：590－591.

［7］ 陳曉春，侯文利，劉星亮.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元形態(tài)和Caspase－9mRNA 表達(dá)的影響［J］.西部醫(yī)學(xué)，2009，21（8）：1 270－1 272.

［8］ Li J，Li Y，Ogle M，et al.DL－3－n－Butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway［J］.Brain Res，2010，1359：216－226.

［9］ 焦東亮，倪秀石，高艷，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后caspase－3表達(dá)的影響［J］.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2007，15（1）：19－23.

［10］ 李國前，王杰華，楊小霞，等.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（9）：682－685.

［11］ 蔣亮亮，張鏞，瑞霞，等.左旋丁基苯酞在體外模擬腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的保護作用［J］.山東醫(yī)藥，2008，48（22）：3－5.