雌激素抑制大鼠肝癌肺轉移機制研究

王永倉 許戈良 趙旭輝 魏 忠 樊 平 戴 寅 謝 釗 劉巧玉

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的原發性肝癌，是我國高發、危害極大的惡性腫瘤，目前確切的病因還不明確，多認為其發病是多因素、多步驟的復雜過程［1］。雌激素對肝癌有抑制作用［2，3］，雌激素對肝癌生成有保護作用，其機制可能與雌激素減少腫瘤微環境中炎癥因子的釋放有關［4，5］。我院進一步研究雌激素對大鼠肝癌模型中肝癌肺轉移形成的影響及其可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料SPF 級雌性SD 大鼠160 只，周齡5 ～6周，體質量120 ～160 g，由安徽省立醫院動物實驗中心飼養。將大鼠隨機分為4 組:對照組、切除卵巢組、假手術組和去卵巢后加雌激素組［給予30 μg/(kg·d)17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，17α-EE2)］。二乙基亞硝胺、N-亞硝基嗎啉、17α-EE2 購自美國Sigma 公司。大鼠雌二醇(estradiol，E2)、17α-EE2、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白介素6(interleukin-6，IL-6)酶聯免疫吸附法試劑盒購自美國R＆D 公司，雌激素受體α(extrogen receptor α，ERα)、磷酸化雌激素受體α(phospho-estrogen receptor alpha，P-ERα)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和IL-6單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模 對切除卵巢組、假手術組和去卵巢后加雌激素組進行手術處理，去卵巢后加雌激素組在術后第2 天即給予17α-EE2 直到實驗結束，劑量為30 μg/(kg·d)。誘癌方法參照本課題組研究方法［6］。

1.2.2 實驗終點 誘癌20 周后集中處死所有大鼠，觀察各組大鼠肝癌及肺轉移發生情況。標本經甲醛固定、石蠟包埋后染色并鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學 染色采用免疫組織化學SP 法檢測各組成瘤大鼠肝癌組織中ERα、P-ERα、HGF 和IL-6 的表達［7］。

1.2.4 RT-PCR 取各組新鮮肝癌組織，用Trizol 試劑(購自美國Promage 公司)提取組織及細胞中總RNA，操作步驟按說明書進行。引物序列及方法見先前研究［8］。1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0 進行統計分析，計數資料數據以百分比表示，統計分析采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝癌及肺轉移發生率大鼠在誘癌20 周后均生成腫瘤，實驗終點各組大鼠肝癌發生率分別為64.00%、92.59%、58.62%和44.44%，切除卵巢組大鼠肝癌發生率明顯高于其他3 組，差異有統計學意義(χ2=7.52，P ＜0.05)。解剖結合鏡檢，提示大鼠生成肝腫瘤為HCC。對照組、切除卵巢組、假手術組和去卵巢后加雌激素組肺轉移發生率分別為25.00%、60.00%、17.65%和16.67%。切除卵巢組大鼠，即去除了雌激素的保護作用后，肝癌肺轉移發生率明顯高于其他3 組，差異有統計學意義(χ2=8.22，P ＜0.05)。見表1。

表1 4 組大鼠肝癌及肺轉移發生率比較

2.2 肝癌組織中ERα、P-ERα、HGF 和IL-6 蛋白表達水平通過免疫組織化學染色，肝癌肺轉移發生率最高的切除卵巢組大鼠肝癌組織中ERα、P-ERα 表達陽性率最低，而HGF 和IL-6 表達陽性率最高，與其他3組相比，差異有統計學意義(χ2=11.22 P ＜0.05)。見表2。

表2 肝癌組織ERα、P-ERα、HGF 和IL-6免疫組化染色陽性率(%)

2.3 肝癌組織中ERα、HGF 和IL-6 分子表達水平

進一步用半定量RT-PCR 方法分析4 組大鼠肝癌組織中ERα、HGF 和IL-6 的mRNA 表達水平，各指標的結果與免疫組織化學染色結果得到了互相驗證。肝癌肺轉移發生率最高的切除卵巢組，大鼠肝癌組織中ERα mRNA 的表達水平最低，而HGF 和IL-6 的mRNA 表達水平最高，與其他3 組相比，差異有統計學意義(χ2=12.64，P ＜0.05)。見圖1、圖2。

3 討論

流行病學研究及臨床病例報道發現女性的肝癌發病率顯著低于男性，這引起了臨床對雌激素抗肝癌作用的關注，雌激素對肝癌的發生發展有保護作用［9，10］，但對肝癌肺轉移的影響研究較少。在本次實驗終點，4組大鼠解剖學結果發現在去除了雌激素的保護作用后，大鼠肝癌肺轉移發生率明顯增高。

國內對于雌激素抑制肝癌遠處肺轉移的作用機制研究報道甚少，近年來對腫瘤的轉移研究熱點之一是腫瘤微環境，已有研究［11］表明腫瘤微環境中產生的促炎因子促進腫瘤的侵襲和轉移。在腫瘤的發生階段這種作用可能并不明顯，一旦腫瘤根深蒂固后這種微環境的變化，尤其是一些炎癥因子的釋放，會改變組織的滲透壓，影響腫瘤組織的營養代謝環境，并發揮出免疫炎性作用，促進腫瘤新生血管生成等，從而有利于腫瘤的侵襲和轉移［12，13］。檢測4 組大鼠肝癌組織中HGF、IL-6、ERα 表達水平，結果顯示大鼠肝癌肺轉移發生率與肝癌組織中ERα 水平表達呈反比，而與HGF、IL-6表達水平成正比。表明大鼠肝癌肺轉移發生率越高，肝癌組織中ERα 表達水平越低，HGF、IL-6 表達水平越高，可以設想雌激素通過作用于ERα 減少了肝癌的肺轉移發生率。

那么雌激素作用于ERα 后，又通過怎樣的機制去降低大鼠肝癌肺轉移的呢?已知HGF 是生物活性較廣泛的生長因子之一，能刺激多種上皮和內皮細胞進行有絲分裂、運動，在組織器官修復、形態發生和腫瘤轉移過程中發揮重要作用，而IL-6 主要由巨噬細胞、T細胞以及大部分腫瘤細胞產生，它在合成以及釋放之后通過IL-6 受體向細胞內轉到信號，在多種腫瘤中發揮著調節腫瘤生長的作用［11］。肝癌在從無到有的發展過程中逐步形成了獨特的炎癥性腫瘤組織代謝環境的生物學特征，其對腫瘤的增殖和轉移具有重要影響［14］。依據本實驗研究結果，可以推測雌激素是強抗氧化劑，其與肝癌細胞內的ERα 結合使其變成P-ERα而活化，介導雌激素發揮一系列生理作用。其中一種作用就是作用于炎癥信號通路，減弱促炎因子(HGF、IL-6)的表達，從而改善肝腫瘤內的炎癥微環境。由于腫瘤炎癥微環境的改善，降低了肝癌肺轉移的發生。本研究結果提示雌激素可能通過拮抗肝癌組織炎性微環境中HGF、IL-6 的生成釋放抑制肝癌向遠處組織如肺發生轉移，這為臨床上肝癌的靶向藥物治療提供了一定理論研究基礎，詳細機制有待進一步的研究。

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