MicroRNA-129-2 靶向調控SOX4 抑制食管癌細胞增殖與侵襲轉移的研究

肖晶鑑 岳海英 韋婷婷 周平婷 康 敏 王仁生

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率位于全球惡性腫瘤第八位，致死率為第六位，其發病率近年來逐步上升［1，2］。食管癌治療的主要手段有手術治療、放療和化療等。由于食管癌起病隱匿，早期癥狀不典型、臨床缺乏有效的早期診斷方法，且食管黏膜下有豐富的毛細淋巴管網，以致70%～80%的食管癌患者確診時已出現淋巴結及遠處轉移，因而目前晚期食管癌仍以藥物治療為主，但總體療效并不理想［3］。因此，探索食管癌發生、發展、轉移的分子機制，確立防治靶點，尋求新的干預策略對提高食管癌的療效具有特殊的重要性和迫切性。本研究擬通過體外實驗探討MicroRNA-129-2 靶向調控SOX4 抑制食管癌細胞增殖與浸潤轉移的作用及作用機制，同時通過體內實驗觀察MicroRNA-129-2 對食管癌細胞增殖的影響。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料食管癌細胞株NMC109 購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫。雄性裸鼠60 只(SPF級)，體質量18 ～22 g(4 ～5 周)，購自廣西醫科大學實驗動物中心。DMEM 低糖細胞培養基為美國Gibco公司生產;質粒提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司生產;LipofectamineTM2000 轉染試劑盒由Invitrogen 公司提供;嘌呤霉素為sigma 公司生產;SOX4多克隆抗體由cell signaling 公司提供;載體miRNASelectTMpEGP-miR 為美國Cell Biolabs 公司生產;MTT 由美國SIGMA 公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養和轉染 食管癌細胞NMC109 培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM 低糖培養基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。miR-129-2 mimics 及miR-129-2 mimics NC 由廣州銳博公司合成。細胞轉染采用LipofectamineTM2000 試劑盒進行，方法參照試劑盒提供的使用說明。同時設立空白對照組，轉染48 h 后加嘌呤霉素篩選陽性克隆。

1.2.2 MTT 實驗檢測細胞增殖 收集對數生長期的miR-129-2 mimics(高表達組)、miR-129-2 mimics NC(mimics NC 組)和未處理的NMC109(空白對照組)細胞，以0.25%胰酶消化，計數，接種于96 孔培養板內，使每孔細胞密度為5 000 個，每組設4 個平行孔并設不含細胞的校正孔，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h 使細胞貼壁，將96 孔板置于37℃，含5%CO2及100%濕度的細胞培養箱中孵育，于終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，繼續孵育4 h 后棄去上清液，加入150 μL 二甲基亞砜，輕輕振蕩10 min，使結晶物完全溶解，于490 nm 波長處在熒光酶聯分析儀上測光吸收值(A 值)，實驗重復3 次。

1.2.3 細胞侵襲實驗檢測 同樣設立上述3 組。在Boyden 小室下室加入含10%FBS 的完全培養基，上、下室之間鋪有聚碳酸酯微孔濾膜(直徑13 mm、孔徑8 μm)，膜上均勻鋪50 μg/孔的人工基底膜膠(Matrigel，BD 公司)，37 ℃溫箱聚合30 min。取對數生長期細胞懸液400 μL(2×104個細胞)加入上室，37 ℃，5%CO2條件下培養48 h。吸去上室液體，擦去膜表面未侵襲的細胞及Matrigel 膠，生理鹽水漂洗，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色。每組設3 個平行樣本，隨機計數5 個400 倍顯微視野下的穿膜細胞數，取其平均值，實驗重復3 次。

1.2.4 Western Blot 檢測蛋白的表達 分別收集上述細胞用蛋白裂解液處理之后離心取上清，分別取各組蛋白30 μL 于8%SDS-PAGE 電泳電轉移到PVDF 膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，覆上SOX4 兔單抗(1 ∶100)過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶200)，37℃孵育1 h，洗膜后含化學發光劑A、B 的水溶液中激發熒光，在暗室中壓X 片，然后顯影、定影，應用Quantity One 軟件進行圖像分析。

1.2.5 裸鼠異種移植瘤動物模型的建立 將對數生長期的高表達組、mimics NC 組的細胞及空白對照組細胞分別經胰酶消化、離心、收集、計數后，制備成5×107 個/mL 的細胞懸液，將細胞懸液注入裸鼠腋窩中部背側皮下，每只裸鼠腋下接種0.2 mL，約1 周后接種原位出現腫瘤，每3 d 測量1 次各組裸鼠的體重和瘤體大小。每組接種裸鼠20 只。測量瘤體最長徑(a)與最短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=πab2/6。觀察30 d 后，處死裸鼠，取瘤組織，稱瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1－處理組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%;腫瘤相對體積:RTV=Vt/V0，Vt 為實驗結束時腫瘤體積，V0 為腫瘤初始體積;相對腫瘤增殖率:T/C(%)=RTV 處理組/RTV 對照組×100%。

1.2.6 統計學方法 使用SPSS19.0 統計軟件進行統計分析，計量資料采用±s 表示，采用單因素方差分析進行統計學處理，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT 實驗檢測細胞增殖作用如圖1 及表1 所示，miR-129-2 高表達組、空白對照組、miR-129-2 mimics NC 組24 小時時已開始出現差異(F=10.419，P ＜0.05);自48 小時起差異逐漸增大(F=317.336，P ＜0.001);第72 小時(F=84.097，P ＜0.001);96 小時(F=215.675，P ＜0.001);120 小時(F=362.735，P ＜0.001)。提示miR-129-2 能顯著降低食管癌NMC109 細胞的增殖能力，隨著培養時間的延長，抑制作用越明顯。

2.2 Transwell 穿膜實驗檢測細胞侵襲力高表達組及mimics NC 組平均通過細胞數分別為(350.00±24.02)個、(699.67±17.79)個。空白對照組的NMC109 細胞組平均通過細胞數為(703.00±18.36)，差異有統計學意義(F=350.00，P ＜0.001)。詳見圖2。

2.3 Western Blot 檢測結果結果顯示，轉染了miR-129-2 mimics 的食管癌NMC109 細胞中SOX4 蛋白表達量(0.10±0.004)比轉染miR-129-2 mimics NC 的細胞中SOX4 蛋白表達量(0.34±0.028)和空白對照組(0.43±0.011)明顯減少，各組間兩兩比較差異均有統計學意義(F=279.602，P ＜0.001)。詳見圖3。

表1 miR-129-2 質粒對NMC109 細胞不同時間增殖活性的影響±s)

表1 miR-129-2 質粒對NMC109 細胞不同時間增殖活性的影響±s)

注:高表達組vs 空白對照比較，*P ＜0.05;高表達組vs mimicsNC 組比較，ΔP ＜0.05

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2.4 miR-129-2 對裸鼠體質量及移植瘤重的影響實驗中各組無一例死亡，miR-129-2 mimics 荷瘤組、miR-129-2 mimics NC 荷瘤組及空白對照組體質量差異均未超過20%。miR-129-2 mimics NC 組與空白對照組裸鼠于左側腋下注射細胞后的第7 天出瘤，miR-129-2 mimics 組在注射后的第10 天可測得瘤體體積。轉染miR-129-2 mimics 的食管癌NMC109 細胞移植瘤具有明顯的抑瘤作用(圖4)，根據定期測得的瘤體長、短徑計算瘤體體積并繪制生長曲線(圖5)，各組瘤體濕重分別為:miR-129-2 mimics 組(0.90±0.03)g、空白對照組(1.17±0.05)g、miR-129-2 mimics NC 組(1.16±0.07)g，差異有統計學意義(F=53.08，P ＜0.01)，詳見圖6、7。各組瘤體終體積和相對腫瘤體積:miR-129-2mimic 組為(278.52±31.10)mm3、(8.70±3.10)，空白對照組為(1041.44±69.69)mm3、(17.78±2.37);miR-129-2mimics NC 組為(1022.26±61.92)mm3、(18.80±4.48)。3 組比較差異有統計學意義(F=352.714，P ＜0.001;F=15.755，P ＜0.001)。詳見表2。miR-129-2 mimics NC 組及空白對照組間無明顯差異(P ＞0.05)。miR-129-2 高表達組抑瘤率為22.1%，相對腫瘤增殖率為46.3%，miR-129-2mimics NC 組抑瘤率為1.1%，相對腫瘤增殖率為94.59%。

3 討論

基因干預性治療是目前探索腫瘤防治的研究熱點，在眾多的癌基因表達調控的研究中，microRNA 的作用已經越來越受到重視。microRNA 是一種真核生物內源性小分子單鏈RNA，是近年來新發現的一類非編碼小RNA。miRNAs 在細胞的增殖、分化及凋亡等方面有重要的作用，并對真核生物基因的表達有調控作用。miRNA 分子通過形成RNA 誘導沉默復合體與靶基因3‘端非翻譯區不完全互補結合，通過誘導mRNA 的切割降解、翻譯抑制或者其他形式的調節機制抑制靶基因的表達。目前，miRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調控研究領域的重要分子和熱點，研究發現半數以上的miRNA 位于腫瘤相關的基因組區域，部分miRNA 在多種腫瘤中異常表達［4］。有文獻證實miRNA 的失調在乳腺癌的發生發展及侵襲轉移中起著重要的作用［5］。

某些癌基因不僅是腫瘤組織的標志，而且在生物學功能上影響腫瘤的發生發展。SOX 基因家族有32個成員，其中SOX4 在腫瘤中的作用尤其引人關注，該家族為控制發育的基因家族，在個體發育過程中對性別分化及組織器官形成起重要作用。近年來大量報道發現SOX4 在多種腫瘤中高表達，如前列腺癌［6］，乳腺癌［7］和肺癌［8］等，這些研究結果表明SOX4 是腫瘤發生發展中重要的癌基因。此外，SOX4 基因與腫瘤的演進、轉移密切相關的作用也得到大量研究結果證實。近年研究均指出SOX4 基因在胃癌、肺癌和子宮內膜癌中的表達與腫瘤的分化、轉移密切相關［9－11］。由此顯示SOX4 基因的高表達可能是腫瘤發生發展的重要因素之一。

表2 3 組間裸鼠移植瘤瘤體濕重、終體積、腫瘤相對體積的比較(±s)

表2 3 組間裸鼠移植瘤瘤體濕重、終體積、腫瘤相對體積的比較(±s)

注:高表達組vs 空白對照，*P ＜0.05;高表達組vs mimics NC 組比較，ΔP ＜0.05

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本課題組前期研究［12］發現，食管癌組織中SOX4蛋白高表達與食管癌的轉移密切相關，而miR-129-2分子在食管癌組織中表達顯著下調;熒光素酶活性分析報告也證實SOX4 基因是miR-129-2 的直接作用靶標。本研究通過向NMC109 細胞中轉入外源性miR-129-2mimics，觀察其在體內外上調miR-129-2 表達后食管癌細胞生物學特性的變化，結果發現，轉染miR-129-2mimics 的NMC109 細胞的體外增殖和侵襲的能力受到明顯的抑制，同時蛋白表達的檢測結果表明上調miR-129-2 后，NMC109 細胞中的SOX4 蛋白表達水平與對照組相比有明顯的下調。這一結果與前期實驗研究相互印證，證實了miR-129-2 對SOX4 蛋白的調控作用。綜合上述結果表明，上調miR-129-2 表達后所呈現的抑瘤作用和抑制轉移作用與下調SOX4 蛋白表達有關。裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長同樣受到明顯抑制，這一現象的發生是否同體外實驗具有相同的機制有待進一步研究。

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