生化糖漿對藥物致不完全流產早孕大鼠子宮內膜血管新生及作用機制研究

萇鳳錦 梁 杰 彭代銀 陳孟夏 孫學勤

近年來，使用藥物終止早期妊娠的人數逐年增加，但是藥物終止早期妊娠可導致較為嚴重的后遺癥，即藥物流產后惡露不盡［1］。另外孕婦產后惡露不盡也是臨床中常見的一種婦科疾病。現代醫學研究認為藥物流產或者產后惡露不盡是由于子宮內瘀血內停、妊娠殘留物殘留于子宮內，致使子宮內膜新生受困，出血時間延長［2］。子宮內膜的修復、新生和子宮內膜中血管的新生是有著十分緊密的關系的，子宮內膜中血管的順利新生是促進子宮內膜新生和縮短藥物流產或妊娠后出血時間的一個重要環節［3，4］。生化糖漿是由安徽中醫藥大學第一附屬醫院研究開發的院內制劑，是由當歸、桃仁、紅花、丹皮、益母草、炒山楂、赤芍、炒蒲黃、川牛膝、川芎、炮姜和炙甘草組成。方中的當歸、桃仁、川芎、炮姜、甘草，養血活血、溫經化瘀止痛;又加紅花、益母草、丹皮、赤芍以增強其活血逐瘀之力;川牛膝性善下行，活血化瘀，滑胎催產，可活血引瘀下行;炒蒲黃、炒山楂活血化瘀、止血止痛;炒山楂善消肉積，殘留的組織屬血肉瘀滯，故炒山楂可化瘀消滯。因此，本文探究生化糖漿對藥物致不完全流產早孕大鼠子宮內膜的血管新生作用以及其作用的機制。根據我國傳統的醫學指出“瘀血不去，新血不生，祛瘀生新”理論，生化糖漿在對藥物流產和產后惡露不盡的患者有很好的治療效果［5］，為生化糖漿研發為新的中藥復方藥提供依據，我院對此進行了相關研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇40 只健康的SD 雄性大鼠和80只健康的SD 雌性大鼠，其中雄性大鼠體質量為250 ～300 g，雌性大鼠的體質量為220 ～260 g，大鼠購買自安徽省實驗動物中心，購買大鼠的許可證號為SCXK(皖)2014-025。

1.2 藥物和試劑生化糖漿(安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，批號:20140103)，桃紅四物湯(藥材桃仁、紅花、當歸、川芎、熟地黃、白芍購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，自行煎煮)，米非司酮和米索前列醇(北京紫竹藥業有限公司，批號:43140805、43140705)，CD34 兔抗鼠多克隆抗體(Bioworlde 公司，批號:361488)，大鼠促血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2)酶聯檢測試劑(美國RnD 公司，批號:P27831)，酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，Tie-2)兔抗鼠多克隆抗體(美國RnD 公司，批號:P27925)。

1.3 主要儀器IX73 型倒置顯微鏡(奧斯巴林IX73)，iMARK 酶標儀(BIORAD)，Centrifuge 5417R 型離心機，病理切片和自動包埋機(德國徠卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 復制藥物流產模型［6］將40 只雄性大鼠和80 只雌性大鼠先分開喂養1 周，其中雄性大鼠是1 只大鼠1 個鼠籠進行喂養。將雄性大鼠和雌性大鼠在上午8 點按照1 ∶2的比例進行合籠，在第2 天清晨5 點進行陰栓和陰道圖片檢測，以發現陰栓或者陰道圖片內有精子時作為雌鼠受孕的第2 天。在雌鼠受孕后的第7 天的早上8 點灌胃米非司酮，劑量為8.3 mg/kg，晚上18 點灌胃米索前列醇，劑量為100 μg/kg，待灌胃米索前列醇后在大鼠的陰道內塞入1 個大小適中的消毒過后的醫用棉球，分別在第2 天的早上8 點和晚上20 點時取出并檢查棉球上部是否有血跡，如有血跡則判定藥物流產模型復制成功，反之失敗，模型復制成功的大鼠共50 只。

1.4.2 大鼠的分組和給藥 將藥物流產模型復制成功的雌鼠隨機分為5 組，分別為模型組、陽性對照組、生化糖漿低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組藥物流產模型雌鼠10 只，另外取10 只正常受孕的雌鼠作為正常對照組。在模型復制成功后的第2 天灌胃正常對照組和模型組大鼠蒸餾水，灌胃陽性對照組大鼠桃紅四物湯，劑量為9.0 g/kg，灌胃生化糖漿低、中、高劑量組大鼠生化糖漿，劑量為5.1、10.2 和20.4 g/kg(按生藥量換算)。每只大鼠灌胃容積為10.0 mL/kg，每天8點進行灌胃，連續灌胃各組大鼠1 周，在末次灌胃1 h后處死大鼠并取樣。

1.4.3 藥物流產大鼠子宮內膜微血管密度(microvessel density，MVD)和Tie-2 檢查 取出各組大鼠的子宮組織，將取出的子宮組織先用生理鹽水沖洗干凈然后在在4%的多聚甲醛內固定，再經過石蠟包埋、病理切片、脫蠟、熱修復、封閉內源性過氧化物酶，滴加CD34和Tie-2 兔抗鼠多克隆抗體，4℃過夜孵育，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精復染，PBS 返藍，脫水封片，在倒置纖維鏡下觀察并記錄視野中的MVD，統計分析Tie-2 的陽性表達的積分光密度。

1.4.4 藥物流產大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 檢查 腹主動脈取血，將各組腹主動脈取得的血先靜置一段時間，然后通過離心機進行離心，離心條件為3 500 r/min，離心10 min，收集離心后的血清，采用酶聯吸附免疫法檢測血清的Ang-1 和Ang-2 的水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 進行統計分析，計量資料以±s 表示，多組間均數比較采用方差分析，計數資料統計分析采用χ2分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜MVD 的影響模型組大鼠子宮內膜MVD 顯著性的小于正常對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05);陽性對照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠子宮內膜MVD 顯著性的高于模型組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1 和圖1。

表1 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜MVD 的影響(±s)

表1 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜MVD 的影響(±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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2.2 生化糖漿對藥物流產大鼠血清中Ang-1 和Ang-2水平的影響模型組大鼠血清中的Ang-1和Ang-2的水平顯著性的小于正常對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05);陽性對照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 的水平顯著性的高于模型組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 生化糖漿對藥物流產大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影響±s，μg/L)

表2 生化糖漿對藥物流產大鼠血清中Ang-1 和Ang-2 水平的影響±s，μg/L)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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2.3 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜中Tie-2 表達的影響Tie-2 主要特異性表達與大鼠子宮內膜中的腺上皮細胞中的胞漿內，另外在血管內皮細胞和間質細胞中也有少量的陽性表達，Tie-2 陽性表達的細胞呈現為棕黃色的顆粒。模型組大鼠子宮內膜中的Tie-2陽性表達的積分吸光度顯著性的小于正常對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05);陽性對照組、生化糖漿中劑量組和生化糖漿高劑量組大鼠子宮內膜中的Tie-2陽性表達的積分吸光度顯著性的高于模型，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表3 和圖2。

3 討論

產后或者藥物流產后惡露不盡是臨床中十分常見的婦科疾病，中醫認為留血、滯血、舊血、污穢之血等原因所致的血液停滯、血脈不通、瘀結不散等可以造成血瘀癥，而中醫認為祛瘀才能生新。產后或者藥物流產后惡露不盡主要是由于子宮內膜不能得到及時的修復，而這一主要原因是由于產后或者藥物流產后機體的體能下降，氣機不足，致使子宮內膜內的血氣出現瘀阻，致使子宮內膜內的血管不能及時的新生［7，8］。

CD34 是血管內皮細胞特異性的標記物，CD34 特異性的表達與血管內皮中可以作為檢測各種組織器官中MVD 檢測的理論依據［9］。在本研究中藥物流產大鼠模型復制成功后，大鼠子宮內膜中的CD34 的表達量較正常對照組顯著性的降低，這表明大鼠經過藥物流產后其子宮內膜中的微血管遭到嚴重的破壞，血管的新生速度顯著降低。而同時陽性對照組、生化糖漿中劑量和高劑量組中大鼠子宮內膜中的CD34 的表達量顯著性的高于模型組，MVD 的增加量顯著性的高于模型組，這說明生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜內的血管新生有顯著的促進作用。

表3 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜中Tie-2 表達的影響(±s)

表3 生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜中Tie-2 表達的影響(±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

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Ang 是繼血管內皮因子之后被發現的又一種具有較強能力調節血管穩定和血管新生的細胞因子，該細胞因子主要有兩個亞型，分別為Ang-1 和Ang-2。Ang-1 和Ang-2 參與機體內的多種重要的生理活動，如子宮內膜血管周期性的變化、胚胎的生長發育等，Ang-1和Ang-2 水平的變化對女性的生殖功能和正常的生理周期變化有著非常重要的作用［10］。而Ang-1 和Ang-2的共同受體是Tie-2，Ang-1 和Ang-2 在機體的生命活動中并不是直接的參與血管新生和穩定的調節，而是通過與Tie-2 受體的結合來實現對血管新生和穩定的調節。當Ang-1 和Tie-2 結合時，Ang-1 會使Tie-2 的磷酸化的速度和程度提高，而當Tie-2 磷酸化后會通過下游的相關途徑促使新生的血管成熟和穩定，這些途徑包括抑制血管內皮細胞的凋亡，促進血管內皮細胞出芽、遷移，以達到血管樹樣結構的形成，聚集血管內皮細胞和基質細胞之間的相互作用。而當Ang-2 和Tie-2 結合時則會拮抗Ang-1 和Tie-2 的結合，進而達到抑制Tie-2 磷酸的目的，降低Ang-1 對血管的穩定性的作用［11］。而Ang-2 對血管的調節作用是和新生血管周圍的微環境相關的，當微環境中有血管內皮生長因子并且濃度達到一定水平時Ang-2 就會和血管內皮生長因子相互協同作用促進微血管的新生，而當微環境中沒有血管內皮生長因子或者血管內皮生長因子的水平極低時，則Ang-2 會抑制血管的新生［12，13］。在本研究中模型組大鼠血清的Ang-1 和Ang-2 及子宮內膜中的Tie-2 水平顯著性的低于正常對照組，而陽性對照組和生化糖漿中、高劑量組大鼠血清中的Ang-1 和Ang-2 及子宮內膜中的Tie-2 水平顯著高于模型組，說明生化糖漿促進藥物流產大鼠子宮內膜血管新生的作用機制可能與通過提高大鼠子宮中的Ang-1、Ang-2 及Tie-2 的表達水平有關，以促進藥物流產大鼠子宮內膜中血管的新生、成熟和穩定。

綜上所述，生化糖漿對藥物流產大鼠子宮內膜中的血管新生有顯著的促進作用，其作用機制可能與通過提高大鼠子宮中的Ang-1、Ang-2 以及Tie-2 的表達水平有關。

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