基因芯片與傳統羅氏培養檢測結核分支桿菌藥敏結果分析

張 偉

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病，結核病可蔓延至全身各個器官，但以肺臟為主，并通過呼吸道傳播［1，2］。該病目前無徹底治愈的方法，臨床主要以殺菌以及對癥治療為主，但部分患者停藥后結核病又復發，病情甚至較之前加重。根據我院多年臨床結核患者治療資料顯示，于結核發病早期對患者進行積極化療，能有效提高臨床療效，將結核控制在較小范圍。此外，對于部分耐藥菌的診斷更是重中之重，因結核病治療周期較長，早期發現耐藥菌，可以提早使用針對性藥物，為結核治療爭取更多時間，需要在臨床加以重視［3－6］。結核桿菌耐藥基因芯片診斷能有效增加結核桿菌耐藥菌檢出率，且該方法快速簡便，可大規模開展［7，8］。為此，我院對116 株結核菌株進行檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測材料結核分支桿菌均由我院檢驗部提供，包括臨床分離培養的結核桿菌菌株84 株(包括活檢、肺泡或支氣管灌洗以及胸腔積液中分離的菌株)以及痰標本結核桿菌菌株64 例。分離培養的結核桿菌以及痰標本均搜集自本院2013 年5 月至2015 年5 月于我院收治的結核病患者。以上菌株均于我院按照結核病細菌學檢驗標準化規程進行分離培養以及鑒定。菌株培養采用改良羅氏法，細菌的藥敏試驗采用絕對濃度法。

1.2 方法用取菌環刮取培養基上的菌落，將菌落溶于10 mL 雙蒸水，用玻璃棒攪拌后放入離心機。以12 000 r/min 離心10 min，去除過濾出沉淀物，倒去上清液，用雙蒸水繼續溶解混勻，加入700 μmol/L 氫氧化鈉溶液靜置2 h，繼續以12 000 r/min 離心10 min，濾出沉淀，用雙蒸水洗凈后，依次加入適量裂解液，吸附劑，煮沸，震蕩后離心10 min，取上清液，用UNIQ-10柱對上清進行純化并濃縮至150 μL 以待PCR 反應。隨后分別經過rpoB 基因擴增、陽性擴增產物的回收、濃縮、測序以及測序產物的純化。最后將產物用310型全自動DNA 測序儀(南京金斯瑞生物科技有限公司)進行測序，觀察并記錄下測序結果。

1.3 評價標準結果判定采用WHO 公布的標準，細菌在40 ～50 μg/mL 的異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的培養基上可以生長即判定為耐藥。1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0 進行統計分析，計數資料以例或百分比表示，統計分析采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法結果比較我院按照全國結核病細菌學檢驗標準化規程進行分支桿菌分類以及鑒定，選取臨床分離的結核桿菌84 株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株。基因檢測中耐藥菌株69 株，65 株結果正確，敏感株檢出15 株，13 株符合真實結果。耐藥基因檢測法靈敏度為97.01%，特異度為76.52%。陽性預測值為94.24%，陰性預測值為86.73%，兩種檢測方法的靈敏度和特異度差異無統計學意義(χ2=0.19，P ＞0.05)。見表1。

2.2 兩種檢測方法痰標本檢測結果比較我院選取痰標本中結核桿菌64 株，其中耐INH 和RFP 菌株32株，INH 或RFP 敏感菌株32 株。基因檢測結果中耐藥菌株36 株，28 株結果與羅氏培養結果一致，敏感株檢出28 株，24 株符合真實結果。耐藥基因檢測法靈敏度為87.56%，特異度為75.00%。陽性預測值為77.81%，陰性預測值為85.73%，與羅氏培養檢驗的敏感度和特異度差異無統計學意義(χ2=0.17，P ＞0.05)。見表2。

表1 兩種檢測方法分離菌株檢測結果比較(例)

表2 兩種檢測方法痰標本檢測結果比較(例)

2.3 耐藥結核桿菌基因檢測結果耐藥結核桿菌檢測結果如下:基因突變片段為516Mat 12 株，基因突變片段為526Mcg8 株，基因突變片段為526Mct 5 株，基因突變片段為526Mag 5 株，基因突變片段為531Mct 40 株，基因突變片段為516Mgt 5 株，其它基因突變片段14 株，可見耐藥基因突變片段以531Mct 為主，其次為516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt 等。

3 討論

結核病是由結核分支桿菌感染引起的慢性傳染病，結核病可侵犯人體多個系統，如呼吸、循環、免疫系統，對人體造成極大的損害［9，10］。雖然我國加大了結核病的防治力度，總的發病增長率有所下降，但我國結核病患者基數仍然比較龐大，需引起重視。結核的治療是一個長期過程，目前各種關于結核桿菌藥物的研究正在開展，但與此同時，隨著抗結核藥的廣泛使用，以及部分患者藥物濫用，各地不斷報道有多耐藥結核桿菌(multi drug resistant mycobacterium tuberculosis，MDR-TB)的出現。2002 ～2006 年，WHO 在進行了大規模的結核調查，調查結果顯示多耐藥結核菌正在全球迅速蔓延;在WHO 對全球184 個國家結核病患者的研究中發現，新近結核桿菌感染患者中出現242 794例MDR-TB 感染者，約占2.7%。而既往已接受治療的患者中MDR-TB 感染率甚至達到了18.5%［11，12］。此外，同時感染HIV 和結核桿菌的患者中56%感染了MDR-TB。更加令人擔憂的是部分地區對于多耐藥結核桿菌的診斷受到多種因素的制約，無法第一時間對多耐藥結核桿菌做出診斷，導致患者在長期使用各種常規化療藥物治療后病情仍無緩解，甚至加重。臨床常用的結核桿菌耐藥性檢查就是藥敏試驗，但該方法對于設備以及操作的要求較高，部分地區醫院無法開展［13］。此外，操作中失誤很容易造成最后結果出現假陽性或者假陰性，因此在臨床難以普及。近年來，也有學者提出多種檢測耐藥菌株的方法，如:噬菌體熒光素酶法、氧化還原酶活性檢測、BACTEC、微孔法［14，15］等，但要滿足臨床檢測，尚需深入研究，以縮短檢查所需時間。本研究主要針對結核病患者的耐藥基因芯片檢測技術，通過對116 株結核桿菌菌株進行研究，取得了一定的成果。

我院按照全國結核病細菌學檢驗標準化規程進行分支桿菌分類以及鑒定，選取臨床分離的結核桿菌84株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株。基因檢測中耐藥菌株69 株，65 株結果正確，敏感株檢出15 株，13 株符合真實結果。耐藥基因檢測法靈敏度為97.01%，特異度為76.52%。陽性預測值為94.24%，陰性預測值為86.73%，兩種檢測方法無明顯差異。基因檢測技術對于分離培養的耐藥結核菌株的檢出，與藥敏法無明顯差異，效果可靠。我院選取痰標本中結核桿菌64 株，其中耐INH 和耐RFP菌株32 株，INH 或RFP 敏感菌株32 株。基因檢測中耐藥菌株36 株，28 株結果與羅氏培養結果一致，敏感株檢出28 株，24 株符合真實結果。耐藥基因檢測法靈敏度為87.56%，特異度75.00%。陽性預測值為77.81%，陰性預測值為85.73%，兩種檢測方法檢驗效果無明顯差異。基因檢測技術對于痰標本中的耐藥結核菌株的檢出，與藥敏法無明顯差異，效果可靠。基因突變片段分別為516Mat 12 株、526Mcg 8 株、526Mct 5株、526Mag 5 株、531Mct 40 株、516Mgt 5 株、其它基因突變片段14 株，可見耐藥基因突變片段以531Mct 為主，其次為516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt等，臨床對于結核桿菌基因型診斷需引起重視。

綜上所述，結核桿菌耐藥基因芯片檢測技術，檢測結果與羅氏培養藥敏試驗結果無明顯差異，且用時較培養短，可大規模操作，值得在臨床廣泛推廣。

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