姜黃素對前列腺癌PC-3細胞HSP27 mRNA表達及凋亡的影響△

徐雷，劉剛，劉朝選

(牡丹江市第一人民醫院 泌尿外科，黑龍江 牡丹江 157011)

·基礎研究·

姜黃素對前列腺癌PC-3細胞HSP27 mRNA表達及凋亡的影響△

徐雷*，劉剛，劉朝選

(牡丹江市第一人民醫院 泌尿外科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：評價姜黃素對前列腺癌PC-3細胞熱休克蛋白27(HSP27)mRNA表達及凋亡的影響，探討其抗前列腺癌的可能作用機制。方法：體外培養人正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌細胞LNCaP、PC-3和DU145。采用RT-PCR檢測各細胞HSP27 mRNA的表達情況。PC-3細胞隨機分為4組，空白對照組：不給藥；高劑量組：給予50 μmol·L-1姜黃素2 μL；低劑量組：給予25 μmol·L-1姜黃素2 μL；另設陰性對照組：給予等體積DMSO。采用RT-PCR檢測PC-3細胞HSP27 mRNA的表達情況，采用TUNEL法檢測PC-3細胞凋亡情況。結果：LNCaP、PC-3和DU145細胞HSP27 mRNA的表達明顯升高，與RWPE-1細胞比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。給藥組PC-3細胞HSP27 mRNA的表達明顯降低，且呈劑量依賴性，與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；給藥組可見大量PC-3細胞凋亡，且呈劑量依賴性，與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：姜黃素抑制HSP27 mRNA的表達和誘導PC-3細胞凋亡，可能是其抗前列腺癌的機制之一。

前列腺癌；姜黃素；PC-3細胞；熱休克蛋白27；細胞凋亡

熱休克蛋白27(heat shock proteins 27，HSP27)是熱休克蛋白家族的主要成員之一，其在正常組織和細胞中表達水平較低，在不同生物及物理因素的刺激條件下，HSP27出現高表達[1]。研究發現，許多惡性腫瘤中HSP27高表達，其表達上調與惡性腫瘤關系密切[2]。HSP27與臨床疾病特別是與腫瘤的關系日益受到重視，但是有關HSP27在前列腺癌發生發展及預后中所起的作用仍存在爭議。前列腺癌是威脅男性健康的一種常見的泌尿生殖系統腫瘤，是美國男性中引起死亡的第二大癌癥，是55歲以上男性的第三位死因。我國前列腺癌的發病率雖低于歐美國家，但隨著我國人口老齡化和飲食結構的改變，近年來其發病率也在不斷地上升，且有迅速增加的趨勢[3-4]。我國前列腺癌的發病率因何低于歐美國家，許多學者設想可能與其飲食結構有關。有研究證實，黃酮、多酚類化合物被認為是預防治療前列腺癌很有潛力的藥物。姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取得到的脂溶性酚類黃色色素，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抑制血管生成及特有的抗腫瘤活性[6]。本研究采用RT-PCR檢測PC-3細胞HSP27 mRNA的表達情況，采用TUNEL法檢測PC-3細胞凋亡情況，旨在評價姜黃素對前列腺癌PC-3細胞HSP27 mRNA表達及凋亡的影響，探討其抗前列腺癌的可能作用機制。

1 材料

姜黃素和DMSO(Sigma公司)，人正常前列腺上皮細胞RWPE-1、前列腺癌細胞LNCaP、PC-3和DU145細胞株(中國科學院上海細胞庫)，F12培養液和胎牛血清(武漢凌飛科技有限公司)，TRIzol試劑盒(上海華舜公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(Bestbio公司)，青霉素、鏈霉素和溴化乙啶等(碧云天生物技術研究所)，細胞培養板(Corning 公司)。姜黃素使用DMSO配制成50 mmol·L-1儲備液，-20 ℃冰箱保存備用，臨用前用F12培養液分別配制成25、50 μmol·L-1溶液。

2 方法

2.1 細胞培養及給藥

RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細胞分別保存在含有10%胎牛血清的F12營養培養基(含青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1)。按照細胞密度1×106個細胞/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養24 h。待80%細胞融合后，更換新鮮培養液，PC-3細胞隨機分為4組，空白對照組：不給藥；高劑量組：給予50 μmol·L-1姜黃素2 μL；低劑量組：給予25 μmol·L-1姜黃素2 μL；另設陰性對照組：給予等體積DMSO，收集培養液用于后續分析。每個實驗步驟至少重復4次。

2.2 RT-PCR檢測HSP27 mRNA的表達

按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA，溶于20 μL DEPC-H2O，依次加入2.5 μL DNA酶，2.5 μL 10×buffer，37 ℃水浴30 min后，65 ℃水浴10 min，分光光度法檢測RNA濃度。HSP27 PCR引物是：5′-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3′(正向)和5′-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3′(反向)，GAPDH擴增產物：5′-GGTCAACGGGTAGGT-GTTTG-3′(正向)和5′-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3′(反向)。HSP27 PCR反應總體積25 μL。使用GeneAm P2400熱循環儀，預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(110 V，35 mA，30 min)，溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進行電泳結果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達相對含量值(灰度比)=HSP27吸光度積分值/GAPDH吸光度積分值。

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡

使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測姜黃素對PC-3細胞凋亡的影響。將細胞用PBS沖洗，-20 ℃甲醇固定15 min，然后PBS沖洗細胞3次，加入50 μL TUNEL反應液，避光37 ℃孵育1 h。PBS沖洗細胞，Hoechst 33258染料37 ℃染色10 min。凋亡指數= TUNEL陽性細胞數/細胞總數。

2.4 數據統計學分析

3 結果

3.1 RT-PCR檢測RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細胞HSP27 mRNA的表達結果

HSP27 mRNA的表達結果依賴于前列腺癌細胞株的惡性程度，惡性程度越高，表達越高。RWPE-1細胞HSP27 mRNA的表達水平為90%，LNCaP、PC-3和DU145細胞HSP27 mRNA的表達水平分別為100%、115%和148%，與RWPE-1細胞比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1。

3.2 姜黃素對HSP27 mRNA表達的影響

RT-PCR檢測各實驗組PC-3細胞的HSP27 mRNA表達水平分別為128%、110%、50%、60%。高劑量組和低劑量組與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

3.3 PC-3細胞凋亡情況

姜黃素高劑量組和低劑量組可見大量凋亡PC-3細胞，且高劑量組高于低劑量組，呈劑量依賴性，與空白組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖3。

注：與RWPE-1細胞比較，*P<0.05。圖1 RT-PCR檢測RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細胞HSP27 mRNA的表達結果

注：與空白對照組比較，*P<0.05；下同。圖2 姜黃素對HSP27 mRNA表達的影響

圖3 姜黃素誘導PC-3細胞凋亡情況(SP×200)

4 討論

HSP作為分子伴侶廣泛存在于原核與真核細胞體內，參與了細胞凋亡、細胞周期的調控以及細胞信號轉導等重要的生物學過程，是生物體內具有廣泛和重要生物學功能的蛋白質[7]。Fuller等[8]研究發現，HSP和腫瘤的發生、發展、轉移、腫瘤免疫、抗腫瘤治療以及腫瘤的預后等關系密切。HSP的表達不僅抑制細胞損傷而且對細胞的保護也起著重要作用，例如控制細胞凋亡和腫瘤免疫反應[9]。

HSP27是HSP亞家族成員之一，在多種腫瘤細胞中均有過表達，其主要的生物學功能是防止各種應激因素對細胞的損傷。另外，HSP27還與調節細胞的增殖、分化及細胞凋亡的信號轉導等有關[10]。近年來，研究HSP27與腫瘤的關系成為熱點。正常組織細胞內HSP27的表達水平很低，應激狀態可致胞內HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達上調。HSP27在腫瘤發病中的作用與其對細胞的影響有關，它在細胞凋亡信號通路中可與相關活性蛋白相互作用并抑制凋亡信號的轉導，抑制細胞凋亡，參與癌癥的發生[11-12]。同時，HSP27高表達能引起腫瘤細胞對柔紅霉素、甲氨蝶呤和長春新堿的耐藥性[13]。HSP27通過調節腫瘤細胞的增殖分化及細胞凋亡的信號轉導，參與腫瘤的發生、侵襲以及轉移過程[14]。HSP27的重要作用是控制肌動蛋白和細胞凋亡的動態變化。HSP可通過腫瘤細胞伴侶分子抗原肽在啟動危險信號或誘導免疫反應而保護腫瘤細胞。目前HSP27與腫瘤的關系日益受到重視，但是有關HSP27在前列腺癌發生發展及預后中所起的作用鮮見報道。Miyake等[15]報道，HSP27、HSP70、HSP90在前列腺癌細胞表達，但是根據Gleason評分和病理分期，只有HSP27表達具有統計學意義，而且HSP27可作為前列腺癌預后判斷的重要指標。Thomas等[16]研究顯示，前列腺癌組織中不同細胞HSP27的著色強度有所不同，具有明顯的異質性，也就是隨著癌組織分化程度的增高，HSP27的表達水平也隨之增高。本研究結果顯示HSP27的表達與前列腺癌細胞的分級呈正相關，即前列腺癌細胞分級越高，其表達水平也就越高。說明癌細胞的發生、發展、惡變，侵襲力等因素與HSP27的表達水平相關。本研究結果與其相一致。

姜黃素是從中藥姜黃中提取的活性成分，具有重要和廣泛的藥理作用，如抗突變、抗炎和抗腫瘤等多種作用[17-18]。姜黃素對多種腫瘤的發生、發展均有明顯抑制效果，具有多靶向的抗腫瘤作用，能夠直接或間接地保護機體細胞免受有害因素的損害，維持細胞正常的新陳代謝和生理功能，從而實現保護作用，由于其活性廣泛，安全有效，因此極具臨床開發前景[19]。目前普遍認為，姜黃素的抑瘤作用機制主要與其誘導腫瘤細胞凋亡有關，它是通過調控抑癌基因、癌基因及其蛋白的表達誘導細胞周期停滯及調控細胞凋亡信號等途徑實現的[20]。本研究的目的旨在討論姜黃素對前列腺癌PC-3細胞凋亡的影響。PC-3細胞來源于人前列腺癌上皮，具有低轉移能力，在調節腫瘤進展方面起到很重要的作用，如細胞分化、細胞增殖、黏附、遷移、細胞外周的蛋白水解作用，是良好的實驗選擇細胞株[21]。故本研究采用TUNEL法檢測PC-3細胞的凋亡情況，實驗結果顯示，姜黃素可以誘導PC-3細胞凋亡，且呈劑量依賴性。同時，RT-PCR技術檢測姜黃素對前列腺癌PC-3細胞HSP27 mRNA表達的結果顯示，姜黃素可以抑制HSP27 mRNA的表達，而且隨著劑量增加，抑制作用增強，具有劑量依賴性。

綜上所述，根據HSP27在前列腺癌細胞中的表達，可以判斷其惡性程度，為臨床制定治療方案和判斷預后提供了重要參考指標；姜黃素可以抑制前列腺癌細胞表達HSP27 mRNA，高濃度的姜黃素抑制作用更強。姜黃素抑制PC-3細胞HSP27 mRNA的表達和誘導PC-3細胞凋亡，可能是其抗前列腺癌的機制之一，然而姜黃素誘導PC-3細胞凋亡的具體作用機制有待深入研究。

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Effect of Curcumin on Prostate Cancer PC-3Cell HSP27mRNA Expression and Apoptosis

XU Lei*，LIU Gang，LIU Chaoxuan

(Department of Orthopedic Surgery，The First People’s Hospital of Mudanjiang，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China)

Objective：To observe the effect of curcumin on prostate cancer PC-3 cell heat shock protein 27 (HSP27) expression and apoptosis，and discuss therapeutic mechanism of curcumin.Methods：RT-PCR of the HSP27 mRNA was implemented by the culture of RWPE-1，LNCaP，PC-3，and DU145 cell lines.Analysis was separately conducted in the control group，control vector group treated by dimethyl sulfoxide，and groups treated with 50 μmol·L-1or 25 μmol·L-12 μL curcumin.TUNEL staining，a way to evaluate PC-3 Cell apoptosis，and the expression of HSP27 mRNA in RT-PCR was observed.Results：Expression of LNCaP，PC-3 and DU145 HSP27 mRNA cells were significantly increased，compared with RWPE-1 cells，the difference was statistically significant (P<0.05).After curcumin treatment，the number of PC-3 Cell apoptosis detected by TUNEL was stronger at a 50 μmol·L-1curcumin concentration compared to that at a 25 μmol·L-1concentration，compared with the control group，the difference was statistically significant (P<0.05)，and the HSP27 mRNAexpression detected by RT-PCR was stronger at a 50 μmol·L-1curcumin concentration compared to that at a 25 μmol·L-1concentration，compared with the control group，the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion：Curcumin induces apoptosis in PC-3 and inhibits HSP27 mRNA expression may be one mechanism of its anti-prostate cancer.

Prostate cancer；curcumin；PC-3 cell；heat shock protein 27；cell apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.011

2014-08-15)

*

徐雷，主治醫師，研究方向：前列腺癌發生機制及生物學研究；E-mail：leixu1978@126.com